埃博拉出血热实验室检测方案第三版.docx

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埃博拉出血热实验室检测方案第三版

埃博拉出血热实验室检测方案（第三版）

埃博拉出血热是一种严重的急性传染病，可发生人-人传播和院内感染,病死率高。

直接接触传播是本病最主要的传播途径。

可以通过接触病人或被感染动物的体液、分泌物、排泄物及其污染物等而感染。

埃博拉出血热的早期临床表现和其他一些病毒性出血热相似，需要通过实验室进行确诊。

在目前阶段，以对病人血液标本检测为主。

为及时检测和确认埃博拉出血热病例，规范实验室检测程序，提高检测质量，为指导病例的管理和出院提供依据，特制定本方案。

一、   检测对象

包括留观病例、疑似病例和确诊病例，病例定义参见国家卫生计生委制定的《埃博拉出血热相关病例诊断和处置路径》。

二、标本采集、保存和运输

（一）标本采集

用分离胶无菌真空促凝管采集静脉血，每管3mL，标记后4℃保存，填写标本采集登记表（附表1）。

留观病例、疑似病例采集发病3日后静脉血2管，送具有埃博拉出血热检测资质的实验室进行埃博拉病毒检测；确诊病例采集恢复期血标本，送国家疾控中心病毒病所进行检测。

（二）标本保存、运送

未分离血清的全血标本应4℃保存，并尽快送具有埃博拉出血热检测资质的实验室分离血清、检测；血清标本长期保存应置于-70℃或以下冰箱，1周内保存可置-20℃冰箱。

标本运输应按照相关生物安全规定，采取A类包装，低温冷藏运输，避免反复冻融（附件1）。

三、检测内容

 埃博拉病毒核酸检测、埃博拉病毒抗原检测和IgM、IgG抗体检测。

四、实验室检测方法

（一）病原学检测

1．核酸检测：

是目前早期诊断、早期发现埃博拉出血热病例的主要检测方法。

为提高检测的敏感性和特异性，用实时荧光PCR方法针对埃博拉病毒2个不同的基因进行检测，在病例筛查时，任一基因检测阳性均可判为埃博拉病毒阳性；在确诊病例出院时，需针对2个基因的检测同时阴性，方可判定为阴性（附件2）。

传统RT-PCR因易出现污染，较少使用，但可以获得病毒基因序列。

发病后3天内，患者血标本中埃博拉病毒核酸检出率低，检测阴性不能排除埃博拉病毒感染，应结合病例的流行病学史和临床表现进行综合判断。

发病后3～10天血标本病毒核酸检出率高。

2.病毒抗原检测：

用酶联免疫法检测埃博拉病毒抗原。

病毒抗原检测阳性可确诊（附件3）。

发病后3天内，血标本中埃博拉病毒抗原检出率低，检测阴性不能排除埃博拉病毒感染，发病后3～10天血标本病毒抗原检出率高。

（二）血清学检测

1.血清特异性IgM抗体：

采用捕获法ELISA方法检测。

IgM抗体阳性可确诊（附件4）。

2.血清特异性IgG抗体：

目前采用间接法ELISA检测IgG抗体。

单份血清埃博拉病毒IgG抗体阳性提示曾感染埃博拉病毒，双份血清埃博拉病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍或者以上增高者可确诊（附件5）。

（三）结果的报告、复核和反馈

埃博拉病毒检测机构应将所有阳性和部分阴性血清标本送中国疾病预防控制中心病毒病所进行复核检测。

实验室检测结果应及时反馈标本送检单位，并尽快上报上级主管部门（附表2）。

五、生物安全

按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全工作。

（一）实验室检测

1．凡涉及埃博拉病毒的分离、培养和动物实验，需在生物安全4级（BSL-4/ABSL-4）实验室内进行。

涉及未经培养有感染性材料的实验活动，需在BSL-3实验室内进行。

血清学检测应在BSL-3实验室内进行，且标本应首先60℃1小时灭活，再进行后续实验操作。

核酸检测时,需在BSL-3实验室生物安全柜内将核酸提取裂解液加入标本中,充分裂解后，完成病毒RNA提取。

对装有病毒RNA的样品管外表面进行彻底消毒后，可在BSL-3实验室以外进行扩增检测。

2．在进行感染性材料操作时，每次标本份数不宜过多，每份标本量不宜过大。

（二）生物安全防护

在实验室处理感染性标本时，应严格按照操作规范在BSL-3实验室内进行。

实验室工作人员应穿着遮盖全身的个人防护装备，包括防渗漏防护服、N95或以上口罩、护目镜、防护面具、防护手套等，当需进行感染性标本离心、较大量标本（≥10mL）分装处理等操作时应使用正压头盔。

实验人员有体表开放式伤口时不宜参加实验活动。

涉及感染性材料的离心应使用有密封盖的离心桶或转头进行标本离心，应在生物安全柜内打开离心转头放入或取出装有标本的离心管。

在标本的采集、包装和实验室检测等过程中所产生的医疗废物，可能具有生物危险性，应当按照《医疗废物管理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》等相关规定及时处理。

实验室检测埃博拉病毒相关感染性标本的实验活动发生意外时，应及时启动相关应急预案（附件6）。

附件：

附件1.埃博拉出血热相关标本采集、包装、运输技术指南

附件2．埃博拉病毒核酸检测方法

附件3．埃博拉病毒核蛋白抗原检测方法（双抗体夹心法ELISA）

附件4．埃博拉病毒IgM抗体检测方法（抗体捕捉法ELISA）

附件5．埃博拉病毒IgG抗体检测方法（间接法ELISA）

附件6.埃博拉出血热相关标本实验活动意外应急预案

附表：

附表1．埃博拉出血热送检材料一览表

附表2．埃博拉出血热实验室检测结果一览表

附件1

埃博拉出血热相关标本采集、包装、运输技术指南

埃博拉出血热（Ebolahemorrhagicfever）是由埃博拉病毒（Ebolavirus）引起的一种急性出血性传染病。

人主要通过接触病人或感染动物的体液、分泌物和排泄物等而感染，临床表现主要为突起发热、出血和多脏器损害，病死率可高达50%-90%。

本病潜伏期为2～21天，通常为8～10天。

2014年，在几内亚、利比里亚和塞拉利昂等西非国家发生历史上最严重的埃博拉出血热暴发疫情。

为指导医疗机构和疾病预防控制机构工作人员对埃博拉出血热相关标本的采集、包装和运输工作，保证生物安全，特制定本指南。

一、生物安全防护

1、所有样本的采集或处理应遵守《医院感染管理规范》和《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关生物安全规定，在标准预防的基础上采用飞沫和接触隔离的预防措施。

2、采集样本时，应严格按照BSL-3级实验室规定做好个人防护。

应穿戴医用防护服、可遮盖口鼻的医用防护口罩（N95）、戴双层防护手套、护目镜、防护面具、鞋套或橡胶靴等。

二、标本采集

（一）采集时间

一般发病后2周内，可在患者血标本中检测到病毒核酸和抗原，发病后3～10天的标本核酸和抗原的检出率高。

在发病后数月内，可在特定分泌物中持续检出病毒。

最早可从发病后2天的患者血清中检出特异性IgM抗体，IgM抗体可维持数月。

发病后7-10天可检出IgG抗体，康复者IgG抗体可维持数年。

发病10-14天以后的标本病毒特异性抗体的检出率高。

因此，应根据不同检测目的确定采样时间，留观病例、疑似病例诊断埃博拉病毒感染应采集发病3天以后的血标本。

（二）标本采集

1. 采血场所除了病人常规护理的材料外，应备有手套、防护服和防护面具等，同时备有洗手的设施和装有消毒液的桶。

2.采集埃博拉出血热患者血样会给医护人员带来风险，应由经过生物安全防护培训的人员执行，采血时应2人在场。

3.采用分离胶无菌真空促凝管采集静脉血，每管3mL，采集后用封口膜封闭管口，标记清楚后放入自封袋或50mL离心管内，并在自封袋或离心管外表面再清楚标记，4℃保存，填写标本采集登记表。

4、留观病例和疑似病例应在发病3天后，采集静脉血2管，送指定的具有埃博拉出血热检测资质的实验室进行埃博拉病毒检测。

5、确诊病例采集恢复期血标本，包括并不限于出院前标本2份，每份2管，采集时间间隔不少于48小时，送国家疾控中心病毒病所进行埃博拉病毒检测，用于指导病例管理。

四、标本包装、运输

（一）所有疑似埃博拉病毒相关感染性标本的运输应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《人间传染的病原微生物名录》等相关规定，采取A类包装，符合UN2814要求。

按照三重包装系统包装：

第一层包装为自封袋或50mL离心管；第二层包装为防水、防漏的安全壳容器；第三层为运输包装组成。

样本应用吸水纸等包裹，固定在防漏自封袋或离心管内。

然后放置在坚固、防水、防漏的第二层安全壳容器中，用吸水纸等填充物将内有标本的自封袋或离心管固定好，然后装入第三层包装。

安全壳容器和外包装须与IATA危险物品条例包装制度650相符合。

（二）填写标本说明两份，写明标本的详细情况、运送者及接收者地址，将标本说明密封在塑料袋里，用胶布分别粘在外层包装的里面和外面并留档以便追踪，方便实验室操作人员查对标本数量。

（三）样本运输之前，应按相关生物安全规定和样本接收单位生物安全管理部门联系，办理相关手续，运送日期确定后立即将运送的时间和运输方式通知接收单位。

五、样本保存和销毁

（一）埃博拉病毒阳性血标本，应根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关生物安全规定保存，实行“双人双锁”和取样“审批”管理。

（二）埃博拉病毒阴性血标本，应在排除埃博拉病毒感染后，转入其他血清库保存或销毁。

（三）所有感染性血清销毁时，均应在在生物安全柜内待其自然融化，60℃ 1小时灭活后，在生物安全柜内，打开样本管，置于有效消毒剂内浸泡，然后高压灭活。

（四）所有销毁样本均应在相应数据库清单内标明，并记录销毁的时间和操作人，阴性样本销毁记录应保存1年以上，阳性样本的销毁记录应保存5年以上。

附件2

埃博拉病毒核酸检测方法

1目的

埃博拉病毒核酸的提取及PCR检测。

2 适用范围

适用于检测血标本中埃博拉病毒核酸。

3 实验前准备

核对被检样品，包括患者的姓名、编号及检测项目等。

4检测仪器设备和材料

实时定量核酸扩增检测仪，常规核酸扩增检测仪，RNA提取试剂盒，一步法RT-PCR扩增试剂盒，一步法实时定量RT-PCR扩增试剂盒等。

5实验步骤

5.1实验准备

5.1.1提取埃博拉病毒RNA要求在BSL-3级实验室内操作。

5.1.2进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。

预约实验场所。

5.2 RNA的提取

使用QIAampViralRNAMini试剂盒提取血清标本中病毒RNA（使用其他试剂盒或方法提取病毒RNA的应参照相应试剂盒说明书或实验室操作手册）。

5.2.1吸取560μl包含载体RNA的AVL缓冲液（核酸提取裂解液）至1.5ml的离心管中。

5.2.2向上述的液体中加入140μl样品，盖好盖后，轻轻的上下颠倒混匀10次，室温孵育10分钟，简单离心使离心管顶端液体落到底部。

5.2.3在样品中加入560μl  96～100％的乙醇，轻轻的上下颠倒混匀10次，再简单离心。

5.2.4小心将630μl液体加入QIAamp小柱中，盖好盖，8000rpm/min离心1min,弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收集管上。

5.2.5打开QIAamp小柱的盖子，重复步骤5.2.4，直至完成全部样品离心。

5.2.6打开盖子，向柱中加入500μlAW1 缓冲液，盖好盖，8000rpm/min离心1min，弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收集管上。

5.2.7打开盖子，加入500μlAW2 缓冲液，盖好盖，14000rpm/min离心3min。

5.2.8将柱子置于一新的2ml收集管上，空离1min。

5.2.9将柱子置于一新的1.5ml离心管上，加入50μlAVE洗脱缓冲液，室温孵育1min,离心8000rpm/min1min。

离心液即为病毒RNA，立即检测或-70℃以下保存。

5.3实时荧光定量RT-PCR法检测埃博拉病毒核酸

为增加埃博拉病毒核酸检测的敏感性和特异性，在用实时荧光定量PCR方法对标本进行检测时，应采用针对埃博拉病毒2个不同的基因同时进行检测，可采用并行的单重PCR或多重PCR方法进行检测。

5.3.1单重PCR参考引物与探针

引物/探针

序列

荧光标记

检测埃博拉病毒核蛋白的引物和探针

ZEBONP-F

CGCCGAGTCTCACTGAATCTG

ZEBONP-R

AGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGT

ZEBONP-P

CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTA

FAM/BHQ-1

检测埃博拉病毒糖蛋白的引物和探针

ZEBOGP-F

TGGGCTGAAAAYTGCTACAATC

ZEBOGP-R

CTTTGTGMACATASCGGCAC

ZEBOGP-P

CTACCAGCAGCGCCAGACGG

FAM/BHQ-1

5.3.2 实时荧光定量RT-PCR扩增

实时荧光定量RT-PCR扩增反应配置体系：

RNA模板5µl，酶（25x）1µl，缓冲液12.5µl，引物（10µM）各1µl，探针（10µM）0.5µl，加水至总体积25µl。

推荐反应条件为50℃30min，95℃10min，95℃15s、60℃45s反应40个循环。

5.3.3 结果判断

以定量荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct<35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的埃博拉病毒核酸检测阳性。

5.3.4 意义

荧光定量PCR是一种灵敏、特异、低污染的病毒核酸检测方法，可以检测标本中的埃博拉病毒。

病例筛查时2个检测基因中，任一基因检测阳性均具有确诊意义。

首例病例确诊应按照国卫发明电[2014]48号《埃博拉出血热病例诊断程序》进行。

在病例管理时，需2个基因同时检测阴性，方可判定为阴性。

5.4一步法常规RT-PCR方法检测埃博拉病毒核酸

如果采用常规RT-PCR的方法检测埃博拉病毒核酸，建议针对病毒基因组2个不同的基因片段同时进行检测,并完成基因序列分析。

5.4.1 参考引物序列

引物

序列

片段大小

检测埃博拉病毒糖蛋白的引物

ZEBOV-GPF

TGGGCTGAAAACTGCTACAATC

ZEBOV-GPR

TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA

570bp

检测埃博拉病毒RNA聚合酶的引物

ZEBOV-LF1

ATCGGAATTTTTCTTTCTCATT

ZEBOV-LR1

ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG

414bp

ZEBOV-LF2

GTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGG

ZEBOV-LR2

ATAATAATCACTCACATGCATATAACA

282bp

5.4.2PCR扩增

采用参考引物对埃博拉病毒不同检测靶标进行PCR扩增。

首先根据所采用的试剂盒说明书推荐反应条件，将病毒RNA逆转录为cDNA。

PCR扩增参考反应条件为94℃预变性2min，然后  94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸1min，反应40个循环，最后72℃延伸10min。

如为套式PCR则开展第二轮扩增。

第二轮分型PCR扩增体系配置采用正向引物ZEBOV-LF2与反向引物ZEBOV-LR2。

推荐反应条件为 94℃预变性2min，然后 94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸10min。

5.4.31.5%浓度琼脂糖电泳分析。

5.4.4结果判读

a阳性：

电泳显示相应大小DNA片段。

b阴性：

无特异性核酸片段扩增。

5.4.5意义

阳性结果可以初步判断埃博拉病毒感染,排除交叉污染。

获得病毒特异性基因序列具有确诊意义。

6清场与消毒

6.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用0.5%次氯酸钠溶液和75%乙醇擦试外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。

6.2 未使用完的感染性生物材料销毁或放入BSL-3级实验室－70℃冰箱，并如实填写操作和处理记录。

6.3 实验区内的污染材料高压处理（121℃高压20min）后，再进行集中高压处理。

附件3

埃博拉病毒核蛋白抗原检测方法（双抗体夹心法ELISA）

1 目的

双抗体夹心法ELISA检测血清中埃博拉病毒核蛋白抗原。

2 适用范围

适用于人血清中埃博拉病毒核蛋白抗原的检测。

3 实验前准备

3.1 核对被检样品，包括患者的姓名、编号及检测项目等。

3.2检测前将60℃ 1小时灭活的待测样品置于BSL-3实验室生物安全柜内。

3.3在洗扳机废液收集桶内加入10%有效氯的消毒剂，加入量为废液桶总体积的5% 。

4 检测项目

本方法检测项目为检测血清中埃博拉病毒核蛋白抗原。

5 检测仪器设备和材料

加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、埃博拉病毒抗原检测试剂盒（双抗体夹心法ELISA）。

6操作步骤（具体请参照试剂盒说明书开展）

6.1 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。

6.2 配液：

将新鲜配制的注入洗板机的洗液桶内。

6.3 编号：

将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，模拟阳性对照2孔和空白对照1孔。

6.4 加稀释液：

每孔加稀释液20µL，空白孔除外。

6.5 加样：

分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各100µL，空白孔除外。

6.6 温育：

用封板膜封板后，置37℃温育60分钟。

6.7 加酶：

每孔加酶标试剂50µL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。

6.8 温育：

用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。

6.9 洗板：

小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍。

6.10显色：

每孔加入显色剂A、B液各50µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色30分钟。

6.11测定：

每孔加终止液50µL，10分钟内测定结果。

设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。

6.12清洗、消毒洗扳机：

按洗扳机内置程序分别采用蒸馏水、乙醇和75%乙醇进行清洗消毒，30分钟后，再用蒸馏水清洗。

7结果判定

7.1 临界值计算：

临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。

7.2 阴性对照的正常值范围：

阴性对照孔A≤0.1。

7.3 阳性对照的正常值范围：

A≥0.50。

7.4阳性判定：

样品A值≥临界值者为埃博拉病毒抗原阳性。

7.5阴性判定：

样品A值＜临界值者为埃博拉病毒抗原阴性。

8意义

阳性结果可以判断为埃博拉病毒感染，但阴性结果并不排除埃博拉病毒感染的可能，应结合病例的流行病学史和临床表现进行综合判断。

9 清场与消毒

9.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用0.5%次氯酸钠溶液和75%乙醇擦试外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。

9.2 将未使用完的感染性生物材料销毁或放入BSL-3级实验室－70℃冰箱，并如实填写操作和处理记录。

9.3 将实验区内的污染材料高压处理（121℃高压20min）后，再进行集中高压处理。

附件4

埃博拉病毒IgM抗体检测（抗体捕捉法ELISA）

1 目的

检测埃博拉病毒特异性IgM抗体。

2 适用范围

适用于人血清中埃博拉病毒特异性IgM抗体的检测。

3 样品接收和准备

3.1核对被检样品，包括患者的姓名、编号及检测项目等。

3.2检测前应将60℃ 1小时热灭活的待测样品置于BSL-3实验室生物安全柜内。

3.3在洗扳机废液收集桶内加入10%有效氯的消毒剂，加入量为废液桶总体积的5% 。

4 检测项目

本方法检测项目为检测血清中病毒特异性IgM抗体。

5 检测仪器设备和材料

加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、埃博拉病毒IgM抗体检测试剂盒等。

6检测步骤（具体请参照试剂盒说明书开展）：

6.1 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。

6.2 配液：

将新鲜配制的注入洗板机的洗液桶内。

6.3加稀释液：

每孔加入样品稀释液100μl，空白及阴阳性对照孔除外。

6.4加样：

在相应孔中加入待测样品10µl，轻轻振荡混匀。

阴、阳性对照加100µl。

6.5温育：

用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。

6.6洗板：

小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍。

6.7加酶：

每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

6.8温育：

操作同6.5。

6.9洗板：

操作同6.6。

6.10显色：

每孔加入显色剂A、B液各50µl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。

6.11测定：

每孔加终止液50µl，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。

设定酶标仪波长于450nm处，用空白孔调零点后测定各孔A值。

6.12清洗、消毒洗扳机：

按洗扳机内置程序分别采用蒸馏水、乙醇和75%乙醇进行清洗消毒，30分钟后，在用蒸馏水清洗。

7结果判定

7.1 临界值计算：

临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。

7.2 阴性对照的正常值范围：

阴性对照孔A≤0.1。

7.3 阳性对照的正常值范围：

A≥0.50。

7.4阳性判定：

样品A值≥临界值者为埃博拉病毒IgM抗体阳性。

7.5阴性判定：

样品A值＜临界值者为埃博拉病毒IgM抗体阴性。

8意义

阳性结果可以判断为埃博拉病毒感染，但阴性结果并不排除埃博拉病毒感染的可能，应结合病例的流行病学史和临床表现进行综合判断。

9 清场与消毒

9.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用0.5%次氯酸钠溶液和75%乙醇擦试外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。

9.2 未使用完的感染性生物材料销毁或放入BSL-3级实验室－70℃或以下冰箱，并如实填写操作和处理记录。

9.3 将实验区内的污染材料高压处理（121℃高压20min）后，再集中高压处理。

附件5

埃博拉病毒IgG抗体检测方法（间接法ELISA）

1 目的

检测埃博拉病毒特异性IgG抗体。

2 适用范围

适用于人血清中埃博拉病毒特异性IgG抗体的检测。

3 实验前准备

3.1核对被检样品，包括患者的姓名、编号及检测项目等。

3.2检测前应将60℃ 1小时热灭活的待测样品置于BSL-3实验室生物安全柜内。

3.3在洗扳机废液收集桶内加入10%有效氯的消毒剂，加入量为废液桶总体积的5% 。

4 检测项目

本方法检测项目为检测血清中埃博拉病毒特异性IgG抗体。

5 检测仪器设备和材料

加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、埃博拉病毒IgG抗体检测试剂盒等。

6 检测步骤（具体请参照试剂盒说明书开展）

6.1 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。

6.2 配液：

将新鲜配制的注入洗板机的洗液桶内。

6.3加稀释液：

每孔加入样品稀释液100μl，空白孔除外。

6.4加样：

在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照10µl，轻轻振荡混匀。

6.5温育：

用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。

6.6洗板：

小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍。

6.7加酶：

每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

6.8温育：

操作同6.5。

6.9洗板：

操作同6.6。

6.10显色：

每孔加入显色剂A、B液各50µl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。

6.11测定：

每孔加终止液50µl，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。

设定酶标仪波长于450nm处，用空白孔调零点后测定各孔A值。

6.12清洗、消毒洗扳机：

按洗扳机内置程序分别采用蒸馏水、乙醇和75%乙醇进行清洗消毒，30分钟后，在用蒸馏水清洗。

7结果判定

7.1 临界值计算：

临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0