植物组织培养室参观与设计3学时.docx
《植物组织培养室参观与设计3学时.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物组织培养室参观与设计3学时.docx（16页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
植物组织培养室参观与设计3学时
实训一植物组织培养室参观与设计（3学时）
一、目的要求
通过参观，使学生掌握如何组建植物组织培养实验室；同时，熟悉组培中涉及的各种仪器设备和器皿用具。
二、仪器与用具
1、仪器：
超净工作台，空调机，蒸馏水发生器或纯水发生器，高压灭菌锅，低温冰箱、普通冰箱，电炉，显微镜，天平、恒温培养箱，烘箱等设备。
2、用具：
各种培养皿，分注器，各种实验器皿和各种器械用具。
三、方法步骤
1、先由指导老师集中介绍组织培养实验室守则及有关注意事项。
2、先由指导老师讲解本次实验的目的、仪器设备和器皿用具的名称及实验步骤。
3、指导老师逐一讲解组培实验室的构建情况，包括准备室（又称化学实验室）、缓冲室、无菌操作室、培养室、驯化室、温室等使用的各种仪器设备和器皿用具的名称用途。
1）准备室（化学实验室）
面积：
20m2左右
用途：
器皿洗涤、培养基配置、分装、高压灭菌，植物材料的预处理，重蒸馏水的制备以及进行生理、生化因素的分析，试管苗出瓶，清洗及整理工作。
要求：
明亮、通风
设备：
工作台，橱柜，水池，仪器，药品等
2）缓冲室
面积：
约3-5m2左右
用途：
进入无菌室前需在缓冲室里换上经过灭菌的工作服、拖鞋，戴上口罩。
设备：
1盏紫外灯，1个配电板，石英电力时控器等
3）无菌操作室（无菌室，接种室）
面积：
10-20m2，视生产规模和超净工作台数量而定。
用途：
材料的灭菌接种，无菌材料的继代，丛生菌的增殖或切割，嫩枝扦插生根等，是关键的部分，关系到培养物的污染率、接种工作效率等重要指标。
要求：
干爽安静、清洁明亮、墙壁光滑平整不易积染灰尘，地面平坦无缝便于清洗和灭菌。
门窗要密闭，一般用移动门窗。
设备：
超净工作台、空调机，医用小平车，操作台、搁架等。
4）培养室
面积：
视培养架多少及培养物数量而定。
用途：
将接种到培养瓶等器皿中的植物材料进行培养的场所。
设备：
（1）培养架与灯光
培养架数目多少视生产规模而定，年产4万--10万苗需4--6个培养架；年产10万--20万苗约需8—10个培养架。
每个培养架一般6层，总高度2m，每0.3m为一层,最下一层距离地面0.2m架宽以0.6m为好，架长以40W日光灯的长度来决定，即约1.26m。
每层架子安装2盏日光灯。
（2）通风设备
在稍高处设置进风气窗，在其对侧近天花板处设置排风窗。
（3）边台、空调机、加湿器（除湿器）、各类显微镜、温湿度计。
5）驯化室
面积：
视生产规模而定。
用途：
组培苗（试管苗）移栽前进行炼苗。
要求：
清洁无菌
设备：
空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器。
6）温室
面积：
视生产规模而定。
用途：
保证试管苗不分季节地常年生产。
设备：
温度控制装置、通风口、喷雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相应药物。
四、作业
1、将本次实训内容整理成实训报告。
2、每人设计一个植物组织培养实验室的组建方案。
实训二MS培养基的配制与灭菌（3学时）
一、目的要求
通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。
二、仪器与用具
1、仪器：
酸度计或pH试纸、电磁搅拌器、电炉
2、用具：
高压灭菌锅、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶（三角瓶）、烧杯、标签
3、试剂：
配制MS培养基的各种母液、生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1N、0.5NNaOH，0.1N、0.5NHCl
三、方法步骤
（一）MS固体培养基的配制
1、将配制好的MS培养基母液从冰箱中取出，按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。
2、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。
注意：
配500ml培养基用1000ml烧杯。
3、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。
如配制1000ml培养基：
需：
MS大量元素母液100ml
MS微量元素母液10ml
MS铁盐母液10ml
MS有机物母液10ml
4、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。
5、加入蔗糖（30g/L），溶解。
6、定容：
用容量瓶。
7、调pH值：
一般pH=5.8。
用0.1N和0.5N的NaOH和HCl将pH调至所需的数值。
注意：
①经高温高压灭菌后，培养基的pH值会下降0.2—0.8，故调整后的pH值应高于目标pH值0.5个单位。
②pH值的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。
③如果pH值与所需的数值相差很大，可先用0.5N的NaOH或HCl调节，至接近时，再用0.1N的酸、碱调节。
以免加入过量的水溶液，导致溶液体积增大，培养基不能很好地凝固（因加入的琼脂量一定）。
8、分装到大三角瓶中（500ml、1000ml）。
9、加琼脂（6-10g/L）。
常用6.6--7g/L
10、封口：
用棉塞或锡箔纸、牛皮纸。
注明培养基名称、配制时间。
或者：
5、加入蔗糖。
6、加琼脂，煮沸1-2分钟（熔化琼脂）。
7、定容，pH值。
8、分注到培养瓶中。
100-150ml培养瓶每瓶装入20-35ml左右的培养基。
（二）MS固体培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）
1、洗涤：
把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。
自然晾干或烘箱干燥。
2、包扎：
用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
3、装水：
在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。
（切忌干烧！
）
4、装物品：
在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
5、灭菌：
将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。
当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。
（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。
）切断电源，让灭菌锅自然冷却。
注意：
①先打开放气阀，再打开锅盖。
（以免锅内压力大而爆炸！
）
②开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。
一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。
③某些生长调节剂如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。
四、作业
1、将本次实训内容写成实训报告。
2、高压灭菌时应注意哪些问题？
3、配制培养基时应注意哪些问题？
实训三棉花下胚轴愈伤组织培养（3学时）
一、目的要求
相对于其他作物，棉花组织培养较难。
通本实验学习棉花组织培养技术，熟悉棉花组织培养的特点、实验条件和所需要的设备，为今后从事棉花遗传转化工作奠定基础。
二、材料与用具
1、材料：
陆地棉的种子实生苗（上次实验得到的苗）
2、仪器：
超净工作台，接种器械（剪子、镊子）、酒精灯、培养皿、高压灭菌锅、电子天平等，大试管（25mm×25cm）。
3、试剂：
MS培养基母液、ZT母液、2，4-D母液、70%乙醇。
三、方法步骤
1、培养基的配制和灭菌：
（方法同前）
采用三种培养基：
MS1：
MS+0.1mg/LZT+0.5mg/L2，4-D
MS1：
MS+0.5mg/LZT+0.1mg/L2，4-D
MS3：
MS+0.1mg/LZT
所有培养基均附加30g/L蔗糖，7g/L琼脂。
在高压灭菌之前，用1mol/LNaOH调整到5.8pH值，分装到50ml三角瓶中，每瓶装培养基大约20-30ml。
2、无菌苗的制备：
（提前一周操作）
选取健康饱满的种子，剥去种毛，进行常规外植体消毒。
接种到含有10ml培养基（MS培养基，不含生长调节剂）的大试管中，每管接种1粒种子，置于光下培养。
3、接种培养：
选取苗龄为7天的生长整齐的无菌苗，在超净工作台上切除子叶和胚根，保留下胚轴。
将下胚轴剪成5mm左右的切段，接种到上面准备好的培养基上，每瓶接种8-10段。
每种培养基接种全班人数/3瓶（即每人接种其中的1-2瓶）。
（1）培养条件：
将材料置于培养室内培养。
培养温度28℃左右，光强2000Lx，每日光照14小时。
（2）实验观察：
定期观察愈伤组织的生长情况。
并详细记录材料生长、分化及污染情况等。
在培养7天时统计污染率。
当培养21天时，统计愈伤组织的诱导率和根分化率，并称量愈伤组织的生长量。
四、作业
1、资料整理
按下列公式计算出愈率、根分化率、污染率和愈伤组织生长量。
出愈率=发生愈伤组织的下胚轴数目/接种下胚轴的总数目×100%
根分化率=分化根的下胚轴数目/接种下胚轴的总数目×100%
污染率=污染瓶数/接种瓶数×100%
愈伤组织生长量（g）=愈伤组织的生长总量/下胚轴的总数目
注意：
在出愈率、根分化率和愈伤组织生长量的计算中，不计算污染的下胚轴的数目。
2、撰写实训报告：
（1）目的；
（2）材料与用具：
材料名称、培养基种子（基本培养基+生长调节剂）、主要实验设备。
（3）实训方法：
简述操作步骤，突出要点。
（4）实训方法：
详细说明本实验中所观察到的现象，并将统计的结果以表的形式列出，并加以简要文字说明。
表：
棉花下胚轴愈伤组织培养结果统计
培养基
接种下胚轴数目
愈伤组织发生
根分化
污染
发生数
生长量（g）
出愈率
（%）
发生数
发生率
（%）
污染数
污染率
（%）
MS1
MS2
MS3
（5）讨论：
对实训结果、观察到的现象及出现的问题加以解释、讨论，应充分发表个人见解，尤其是激素种类和浓度配比对棉花下胚轴愈伤组织诱导和生长的影响。
实训四百合鳞茎培养（3学时）
一、目的要求
1、学习和掌握百合鳞茎培养的基本方法和技术。
2、掌握外植体由器官发生途径形成不定芽的基本操作技术。
二、材料、仪器与试剂
1、材料：
百合；
2、仪器：
超净工作台、灭菌锅、接种器械、烧杯、培养皿、移液管、酒精灯等；
3、试剂：
（1）MS培养基+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L
（或者：
MS培养基+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L）
（2）70%乙醇
（3）0.1%升汞
三、方法步骤
1、外植体消毒：
取健康的百合鳞茎片，先用洗涤剂清洗干净。
再用70%酒精消毒30-60秒，0.1%升汞消毒20分钟，再用无菌水冲洗3-5次。
2、外植体的接种和培养：
较大鳞片可切成小块，在无菌条件下直接接种于固体培养基中培养，每瓶6-10块。
培养温度一般为25℃±1℃，每次用日光灯照射10小时左右。
光照度为1000-1500Lx。
3、培养基的选用：
一般以MS培养基为主，只要附加适当的植物生长剂即可。
生长素一般用NAA（或2，4-D及IBA）0.5mg/L。
细胞分裂素一般用BA（或KT）0.1-1.0mg/L）。
为了促进根系和增加鳞茎重量，可考虑光暗交替培养和适当增加生长素的浓度。
4、试管苗的诱导：
（1）由鳞片小切块诱导成苗。
鳞片小切苗丛，块接种后，一般先分化出黄绿色或绿色的球形突起的小芽点，继而芽点逐渐增大长成小鳞茎，并可生长出叶片，生根后移栽于盆中。
（2）由叶片诱导成苗。
用鳞片小切块诱导分化出的苗丛，在超净工作台上取其无菌叶片，接种于培养基上，培养半个月后可分化出带根的小鳞茎。
培养2个月后，每个单叶片形成的小鳞茎一般又可分化出带有根系的丛生小鳞茎4-6个。
叶片培养可直接插入培养基中，但要注意极性，不可倒置。
叶片也可平放于培养基中培养。
（3）由无菌小鳞片诱导成苗。
利用试管中的无菌小鳞茎，在超净工作台上将小鳞片逐片接种于培养基中（鳞片基部向下或内侧面向上）。
（4）由愈伤组织诱导成苗。
各种百合外植体在分化成苗的过程中，常常也可伴随着增殖具有颗粒状似胚性细胞团的愈伤组织。
该愈伤组织在连续不断的继代培养中，一方面继续不断地增殖相似的愈伤组织，另一方面又不断地分化成苗。
一般每个试管里的愈伤组织可分化成苗20-40个。
这样即可周而复始地分化出大量的试管苗。
四、撰写实训报告。
附：
百合在生产上存在着三个拯待解决的问题：
一是用种量很大，每667m2百合按常规栽培，需用种250Kg；
二是繁殖系数低，每667m2只能收获1000Kg左右：
三是难以进行有性繁殖。
因而采用组织培养方法对百合进行快速无性繁殖很有前途。
实训五大蒜叶片培养（3学时）
一、目的要求
学习和掌握大蒜叶片培养的基本方法和技术，为大蒜径尖培养奠定基础。
目前大蒜生产上存在的主要问题是病毒造成的品种退化，使产量降低。
为了克服病毒的侵染，采用径尖培养进行脱毒和快繁。
二、材料、仪器与试剂
1、材料：
实用大蒜；
2、仪器：
超净工作台、灭菌锅、电子天平、接种器械、烧杯、培养皿、培养瓶等；
3、试剂：
（1）MS1诱导培养基：
MS+500mg/L水解乳蛋白+1000mg/L酵母提取物+2mg/L2，4-D
（2）分化培养基：
MS2：
MS+6-BA2mg/L+NAA0.01mg/L；
MS3：
MS+6-BA2mg/L+NAA0.05mg/L；
MS4：
MS+6-BA0.05mg/L+NAA5mg/L+酵母提取物800mg/L。
三、方法步骤
1、以食用大蒜的未经萌动的肉质瓣状小鳞茎为材料，在无菌条件下去掉保护叶，用刀片将贮藏叶切成长、宽和深度各为3mm的小块；然后接种于MS1培养基上，诱导愈伤组织。
2、培养3天后，就有少数外植体开始膨大，10天有愈伤组织出现。
其后，在愈伤组织表面产生大量光滑的小球体。
3、将愈伤组织转移到去掉2，4-D的分化培养基上，经一个月左右可分化出苗，以MS1及MS3培养基配方最好，苗的分化频率可达80%以上。
在生长素较高的MS4培养基上，一个月后，不仅有苗分化，而且还可分化出根。
四、作业
写出该实训的报告，并比较3种分化培养基的培养效果
实训六菊花的茎尖培养（3学时）
一、目的要求
1、学习和掌握菊花外植体表面消毒技术
2、熟练掌握菊花茎尖切割及培养的操作基本技术。
二、材料、仪器与试剂
1、材料：
菊花嫩茎；
2、仪器：
超净工作台、灭菌锅、接种器械、烧杯、培养皿、显微镜、酒精灯等；
3、试剂：
（1）MS培养基
（2）洗涤液或洗衣粉水溶液
（3）0.1%升汞
三、方法步骤
1、剥取茎尖和腋芽。
切取植株的顶芽或腋芽3-5cm，去除叶片，保留互芽的嫩叶柄。
2、洗涤和消毒。
用洗涤液或洗衣粉水洗涤，尤其是腋芽的叶柄处用软毛刷涮擦，再用清水反复冲洗干净。
置于超净无菌条件下，将材料用0.1%升汞溶液进行表面消毒，轻轻地摇动，消毒彻底，再用无菌水冲洗数次，放到无菌的吸水纸吸干水分。
3、茎尖剥离。
在解剖镜下，将材料置无菌的盘子内，剥去端部的嫩苞叶，露出锥形体，切取0.3mm和0.5mm两个不同长度的茎尖，带两个叶原基。
4、接种。
将切取的茎尖迅速接种到培养基上，防止茎尖脱水。
接种时注意茎尖向上，不能倒置。
四、撰写实训报告
1、调查外植体表面消毒接种成功率。
2、分析接种不成功的原因。
3、调查0.3mm和0.5mm两个不同长度的茎尖接种成功率。
实训七甘薯的脱毒与快繁（3学时）
一、目的要求
学习和掌握甘薯的脱毒与快繁技术。
二、材料、仪器与试剂
1、材料：
甘薯（IpomoeabatatasL.Lam）；
2、仪器：
超净工作台、灭菌锅、接种器械、烧杯、培养皿、显微镜、酒精灯等；
3、试剂：
（1）MS培养基+0.1~0.2mg/LIAA+0.1~0.2mg/L6-BA+3%蔗糖+0.05mg/LGA3
（2）70%乙醇，0.1%多菌灵，0.1%升汞，10%次氯酸钠，等。
三、方法步骤
1、优良母株选择。
选择适宜当地栽培的高产优质或特殊用途的生长健壮的甘薯品种植株作为母株，取枝条，剪去叶片后切成数段。
每段带有一个腋芽，含顶芽2-3节。
2、材料消毒。
剪好的茎段经流水冲洗数分钟，用滤纸吸干表面水分后于70%乙醇中浸泡10s，再用0.1%多菌灵浸泡10min，再用0.1%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗5次；或用10%次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水冲洗3次。
3、茎尖切割。
将消毒好的茎放在解剖镜下，无菌剥去顶芽和腋芽上较大的幼叶，切取0.3~0.5mm含1~2个叶原基的茎尖组织，接种在培养基上。
4、茎尖培养。
培养基：
MS培养基+0.1~0.2mg/LIAA+0.1~0.2mg/L6-BA+3%蔗糖+0.05mg/LGA3，pH5.6-6.0
培养条件：
温度25-28℃，光照度1500-2000lx，光照14h/d
5、茎尖苗的初级快繁。
当薯苗长至3-6cm时，将小植株切段进行短枝扦插，除顶芽一般带1-2片展开叶片外，其余的切段都是具一节一叶的短枝。
切段直插于三角瓶内无植物生长物质的MS培养基中（注意腋芽勿埋入培养基内），条件同茎尖培养。
2-3d内，切段基部即产生不定根，30d左右长成具有6-8片展开叶试管苗。
6、脱毒鉴定。
茎尖培养产生的试管苗，经严格检测后，才能确认为脱毒苗。
确认脱度种薯及幼苗是否带毒及其种类常用的鉴定方法有：
甘薯病毒病症状学诊断法、指示植物检定法、电子显微镜检定法、血清学检测法等。
四、撰写实训报告
实训八水稻、草莓花药培养（3学时）
一、目的要求
花药培养是将花药发育到一定阶段的花药接种到培养基上进行离题培养，以改变花药中花粉细胞（粒）的发育阶段而获得花粉植株的技术。
我国利用花药培养进行水稻新品种选育（单倍体育种）十分成功，草莓花药培养可应用于品种培育，并成功地用于培养无病毒草莓苗。
本次实训学习水稻和草莓花药接种培养技术，熟悉所需设备和实验条件。
二、材料与用具
1、材料：
孕穗期的水稻穗；草莓花蕾。
2、仪器与用具：
光学显微镜、盖玻片、载玻片、超净工作台、手术剪、接种环、枪状镊子（长15~20cm）、酒精灯、培养皿、广口瓶、滤纸、纱布、脱脂棉、刻度搪瓷缸、高压灭菌锅、电炉等。
3、试剂：
70%乙醇、0.1%升汞、1%I2-KI液、无菌水、醋酸洋红。
三、方法步骤
1、培养基配置。
表1水稻花药培养基
培养目的
基本培养基
生长调节物质
蔗糖（%）
诱导愈伤组织
或花粉胚
N6
简化马铃薯培养基
2,4-D2.0
2,4-D2.0
4~6（麦芽糖）
6
愈伤组织分化绿苗
N6
Kt1.0+IAA0.2
（或椰奶15%）
3
壮苗
N6
无
3
表2草莓花药培养基
培养目的
培养基
附加成分
蔗糖
pH
诱导愈伤组织
芽分化
芽增殖（继代）
生根
MS+6-BA0.5+NAA0.2
MS+6-BA0.5+Kt0.5
MS+6-BA0.5+GA0.1
1/2MS+BA0.1~0.2
LH100
LH100
LH100
—
30000
20000
20000
20000
5.8
5.8
5.8
5.8
2、材料的选择。
（1）水稻幼穗采集。
水稻花药培养，应采用花粉单核中晚期的花药，此时为水稻孕穗期。
（2）草莓花药培养，宜采用花药发育至单核靠边期的花药。
3、材料预处理。
（1）将装有稻穗的塑料袋口扎好，置10℃下处理2~4d（可放置到14d），以提高花粉胚和愈伤组织诱导率。
（2）将田间采集的草莓花蕾，用湿润纱布包好放塑料袋中，扎好袋口，置4℃左右冷藏箱中放置1~2d。
4、材料消毒。
将剪下的水稻颍花置于高压灭菌的广口瓶中，用70%乙醇浸泡30s，再用0.1%升汞浸泡消毒7~8min（或饱和漂白粉上清液浸泡10~20min），倾出升汞，用无菌水洗涤4~5次，备用，材料消毒在超净工作台上进行。
草莓花蕾消毒参照苹果种子的消毒。
5、接种培养。
6、培养接种结束，将材料置培养室内培养。
培养过程中注意观察，记录材料生长、分化及污染情况等。
四、实训报告。
1、资料整理。
按下列公式计算出愈率、花粉胚发生率、污染率。
出愈率=发生愈伤组织的花药总数/接种花药总数×100%
花粉胚发生率=形成花粉胚的花药总数/接种花药总数×100%
污染率=污染管（瓶）数/接种总管（瓶）数×100%
2、报告撰写。
2、撰写实验报告：
（1）目的。
简述本次实训的目的。
（2）材料。
植物材料（种类、器官或组织），培养基（基本培养基+生长调节剂）、主要实验设备。
（3）操作方法。
简述操作步骤，突出要点。
（4）实训结果。
表水稻（草莓）花药培养结果统计
接种管数
接种花药数
愈伤组织发生
花药胚发生
污染
发生花药数
出愈率
（%）
发生花药数
发生率
（%）
管数
污染率
（%）
（5）讨论。
升级会员 