健康食品之促进铁吸收功能评价方法.docx

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健康食品之促进铁吸收功能评价方法

健康食品之促進鐵吸收功能評估方法

衛署食字第0950405557號公告附件

一、背景說明（1-16）

根據聯合國糧農組織與世界衛生組織（FAO/WHO）之報告，缺鐵仍是不可忽視的營養缺乏問題之一，除了盛行於經濟落後與開發中國家之外，在經濟富裕之歐美先進國家也沒有完全解決。

缺鐵的定義是體內鐵儲存耗竭，並且增加貧血的危險，而貧血是缺鐵末期的症狀。

美國自1943年開始強制實行麵粉營養強化措施，添加的營養素包括維生素B1、B2、菸鹼素與鐵，然而根據美國最新之健康調查NHANESIII（1988-1994），美國缺鐵盛行率以生育年齡女性有9-11%最高，其次是1-2歲幼兒9%，50歲以上女性也有5-7%之多，男性缺鐵率則低於2%。

瑞典之調查指出其青少年之缺鐵盛行率超過15%，女性甚至高達40%。

我國「第一次國民營養健康狀況變遷調查」同時利用血鐵蛋白濃度、運鐵蛋白飽和度和血紅素濃度等血液指標評估鐵營養狀況。

四歲以上國人之總缺鐵率為男性2.1%，女性10.7%﹔鐵儲存耗盡之比例為男性1.3%，女性7.7%﹔缺鐵貧血率為男性0.2%，女性2.1%﹔國人缺鐵問題與歐美國家雷同，都是以無臨床症狀之缺鐵為主，並且有明顯的性別差異，以女性較男性為嚴重。

除了65歲以上老人兩性之缺鐵率均高之外，男性缺鐵率最高的是13-18歲，與青春期之快速成長有關﹔女性則從13-64歲都有9%以上之缺鐵率，以30-50歲有14.2%最高，快速成長與月經都有重要的影響，另外因體重控制而減少攝食量或食物選用不當，也可能增加缺鐵之危險。

缺鐵為一漸進而連續的變化過程，初期為體內儲存之鐵耗盡，進而使血液中運送之鐵短缺，逐漸不敷造血組織之需要，最後導致血紅素之合成不足，而造成貧血症狀。

因此，缺鐵可分為「無貧血性缺鐵」與「缺鐵性貧血」兩大類。

貧血發生之前，通常沒有明顯易辨之症狀。

貧血發生之後，多種生理機能不良之症狀就明顯可辨，諸如﹕肌肉勞動效力明顯降低，無法從事劇烈短促的活動，影響肌肉的生理和能量代謝效率，增加心臟的負荷等。

缺鐵貧血與嬰幼兒精神性運動能力不良有關，並且有行為異常的現象，使心智發展明顯較差，包括﹕語言能力差，運動協調與平衡不佳，注意力、反應靈敏度與情緒的分數均明顯較低，甚至有長期的影響，因為長期追蹤發現，缺鐵貧血幼兒於五年或十年後其認知能力與學習成就仍然較為低落。

無貧血性缺鐵也會降低認知能力，缺鐵之高中女生經過鐵補充之後，可以提升其語言學習與記憶能力。

美國NHANESIII調查中發現，6-16歲兒童青少年中，缺鐵者的數學得分顯著較健康者為低，風險比例（oddsratio）高達2.3。

富裕社會中無貧血性缺鐵盛行率仍然居高，由於涉及學習發展，故對兒童青少年的鐵營養狀況必須密切注意。

缺鐵影響免疫機能，根據人體與動物實驗證實，缺鐵主要影響兩項免疫功能﹕中性白血球吞噬細菌能力降低，T淋巴細胞對細胞增生劑或抗原的反應降低。

缺鐵還會增加鉛中毒的危險，美國兒童中缺鐵者鉛中毒的比例較健康者高出3~4倍。

因為缺鐵時小腸負責鐵吸收的蛋白質DMT1表現增加，但是它缺乏專一性，故對其他二價金屬元素，包括鉛、鉻等重金屬的吸收率也伴隨增高。

國人缺鐵問題仍然存在，我國並未全面實行食物加鐵強化之措施，因為缺鐵問題有個人之差異，並非人人需要補鐵，而且體內鐵儲存大幅增加並不增添益處。

因此發展各種補鐵食品以供消費者依個人需要選用，配合個人日常飲食以維護鐵營養之充足，有其積極正面之意義。

已知影響鐵吸收的主要因素有鐵的化學形式與鐵可用率（bioavailability）。

鐵的化學形式主要區分為「血鐵質」﹙hemeiron﹚與「非血鐵質」﹙non-hemeiron﹚兩種。

「血鐵質」主要來自肉類，其吸收不受其他飲食成分的影響，但是受鐵營養狀況之調節，吸收率平均25%，缺鐵時可提高到40%，鐵充足時可降到10%。

長時間高溫烹調會使「血鐵質」分解成「非血鐵質」。

「非鐵血質」來自各種植物性食品，鐵蛋白（ferritin）以及鐵補充劑等等，其吸收率平均約7.5%，缺鐵時可提高到21%，鐵充足時會降為2.5%。

飲食成分會影響「非血鐵質」的吸收率，促進吸收的成分主要有維生素C和禽畜魚等肉類，維生素C含量在25-100mg之間與鐵吸收率有正比關係，增高劑量並無進一步的效益。

肉類包括禽、畜、魚貝等動物之肌肉蛋白質，其消化分解之小分子產物可以與鐵形成可溶性錯合物以增加鐵的溶解度而促進吸收。

西式乳酸發酵之蔬菜、發酵黃豆製品也有促進鐵吸收的效益。

由於飲食鐵質之吸收並不完全，故以鐵可用率代表食物或飲食中可被人體正常消化、吸收並供生理利用的鐵，這是綜合數個生理過程的結果，這些過程大致上可分為三個步驟：

（1）消化，

（2）小腸細胞攝入鐵（ironuptake）與血液運輸，及（3）形成功能性蛋白質以執行生理功能。

因此，測量上述過程可以反映鐵可用率。

二、鐵可用率評估原理（4,15,16）

目前食物鐵可用率的評估方法分為體外（invitro）測量法、動物實驗法與人體實驗法三種。

體外測量法有體外消化透析法（invitrodigestionanddialysis）與體外消化Caco-2細胞攝鐵法（invitro/Caco-2cellculturemodel）。

體外消化透析法是根據可溶性、小分子鐵錯合物才可能被人體吸收的原理，採用模擬胃腸消化作用之條件，將食物消化分解後，利用透析膜分離小分子含鐵成分，稱為「可透析鐵」﹙dialyzableiron﹚，測量其比例以間接代表鐵可用率，所得之結果與人體鐵吸收率顯著相關。

體外消化Caco-2細胞攝鐵法除了利用模擬胃腸消化作用之條件與透析膜分離小分子含鐵成分之外，加上細胞模式以模擬小腸之吸收作用，吸收之鐵可誘導細胞內鐵蛋白之生合成，兩者有正相關性，故以鐵蛋白量間接代表鐵可用率。

Caco-2細胞源自人類大腸腺細胞瘤（colonadeno-carcinoma），會自發性分化，並擁有許多小腸細胞的特性，包括極化（polarization）的型態、形成微絨毛（microvilli）與tightjunction，細胞內有儲鐵用之鐵蛋白，並且具有與鐵吸收相關的DMT1、HFE等各種蛋白質，多種促進或抑制鐵吸收之成分可影響其攝鐵作用，與小腸之反應相似。

在美國國家衛生院﹙NIH﹚theOfficeofDietarySupplements與theAmericanSocietyofNutritionalSciences的研討會中，此法被認為具有高度的應用價值，所測得之結果與人體鐵吸收率顯著相關。

動物實驗法採用最為普遍的是AOAC（AssociationofOfficialAnalyticalChemists）建議之「大鼠血紅素再生法」（rathemoglobinrepletionbioassay）。

其原理是利用缺鐵貧血大鼠對食物鐵質有最大的吸收能力，並且優先用於合成血紅素，故飼以含鐵食物或化合物後，追蹤其血紅素濃度之增加，可以反映食物之鐵可用率，可用來區別不同鐵源的利用效率。

此法屬於『終點』﹙endpoint﹚測量法，符合鐵可用率的定義。

國際營養性貧血顧問小組（InternationalNutritionalAnemiaConsultativeGroups）曾經比較AOAC法與人體試驗測得之鐵可用率，發現兩者顯著相關，可作為人體鐵可用率之參考。

動物實驗法之主要限制是不適合評估促進鐵吸收之成分，因為缺鐵貧血大鼠的鐵吸收率很高，足以掩飾其他促進因子的效應。

AOAC法自1974年建立以來並無任何修訂版本，然而隨著動物實驗技術之進步，以及鐵吸收機制之新知，其基礎飼料配方已不適用，修訂之配方（表一）及條件應參考蕭氏之行政院衛生署委託計畫研究報告《改良並建立我國保健食品補鐵機能評估的檢測方法》（36）。

人體實驗法可以直接反映食品之鐵可用率，是補鐵功能的最佳指標。

雖然鐵之吸收利用可以放射性同位素鐵追蹤定量，但此等方法在國內難以執行。

可行的方法是以缺鐵貧血者為試驗對象之血紅素增生法，提供促進鐵吸收健康食品，使其依照食品使用說明服用，定期追蹤血紅素等鐵營養相關指標之增加量，據以評估鐵可用率。

人體對鐵之吸收利用有其恆定調控機制，健康食品可以經由改變鐵之形式，提供促進鐵吸收之成分或去除抑制鐵吸收之成分等策略以提高食品之鐵可用率。

因此健康食品促進鐵吸收功效可以依產品特性採用不同評估方法（表一）。

實驗結果符合下列三項標準之一，即可評定為具有促進鐵吸收之功能：

1.人體實驗結果獲得顯著的促進效應

2.體外消化—Caco-2細胞攝鐵實驗或大鼠血紅素再生實驗獲得顯著的促進效應

3.體外消化透析法配合體外消化—Caco-2細胞攝鐵實驗，或體外消化透析法配合動物實驗獲得顯著的促進效應。

表一、促進鐵吸收之產品策略與適用之評估方法

產品策略

適用之評估方法

改變鐵之形式

1.人體試驗

2.大鼠血紅素再生法

3.體外消化Caco-2細胞攝鐵法

4.體外消化透析法＋體外消化Caco-2細胞攝鐵法

5.體外消化透析法＋大鼠血紅素再生法

提供促進鐵吸收之成分

1.人體試驗

2.體外消化Caco-2細胞攝鐵法

3.體外消化透析法＋Caco-2細胞實驗

去除抑制鐵吸收之成分

1.人體試驗

2.大鼠血紅素再生法

3.體外消化Caco-2細胞攝鐵法

4.體外消化透析法＋Caco-2細胞攝鐵法

5.體外消化透析法＋大鼠血紅素再生法

三、評估方法與步驟

（一）體外消化透析法（invitrodigestionanddialysis）：

簡稱「透析法」（17-21）

1.儀器設備

食物研磨機、pH測定儀（pHmeter）、控溫震盪培養箱或控溫震盪水浴槽（shakerincubator）、原子吸收光譜儀（atomicabsorptionphotometer）、分光光度計（spectrophotometer）。

2.主要器材

透析膜MWCO6,000〜8,000（Spectra/Por），使用之前以去離子水浸泡12小時；有蓋高型玻璃燒杯，容量100-150mL；透析膜夾等。

實驗用玻璃器皿均應以酸液浸泡，經去離子水沖淨，去除鐵之污染後方可使用。

3.藥品與試劑

胃蛋白酶（pepsin）：

porcine，活性800-2500units/mgprotein。

胰臟酵素（pancreatin）：

porcine，活性4xU.S.P.specifications。

膽汁萃取物（bileextract）：

glycineandtaurineconjugatesofhyodeoxycholicandotherbilesalts。

各種酸鹼試劑與藥品必須無微量礦物質污染，包括：

HCl、NaHCO3、trichloroaceticacid（TCA）、hydroxylaminehydrochloride、sodiumacetate、bathophenanthrolinedisulfonate、原子吸光分析用鐵標準溶液等。

胃蛋白酶溶液（pepsinsolution），簡稱「胃液」

每100mL的0.1NHCl溶液中含2.5-5g胃蛋白酶，加入離子交換樹脂（Chelex-100）2.5-5g，室溫震盪反應30分鐘，離心或過濾移除樹脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清瓶中，儲存於4℃下，於一星期之內使用。

胰液－膽鹽懸浮液（pancreatin-bilesuspension），簡稱「胰液」

每100mL的0.1MNaHCO3溶液中含0.2-0.4g胰臟酵素及1.2-2.5g膽汁萃取物，加入離子交換樹脂（Chelex-100）15g，室溫震盪反應30分鐘，離心或過濾移除樹脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清瓶中，儲存於4℃下，於一星期之內使用。

還原劑溶液

於250mL去離子水中溶解100ghydroxylaminehydrochloride，加入離子交換樹脂（Chelex-100）2-5g，室溫震盪反應30分鐘，離心或過濾移除樹脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清瓶中備用。

蛋白質沉澱劑

100gTCA以去離子水定容至500mL，嚴防鐵污染。

鐵呈色劑，可透析鐵定量分析之用，組成分為：

250mgbathophenanthrolinedisulfonate先溶於50mL去離子水，再加入250mL還原劑溶液及4MNa-acetate溶液500mL，最後以去離子水定容至1L。

鐵對照溶液

以FeSO4溶於0.01NHCl，適用的濃度為10-100μM，實驗時選用與測試樣品相當之濃度，使用時新鮮配製。

4.實驗方法及步驟

每次實驗應包含以下組別：

（1）控制組：

鐵對照溶液或其與不含健康食品之基礎飲食的組合，含鐵量與實驗組相當，除了不含健康食品之外，基礎飲食之組成與特性應與實驗組相近。

（2）正對照組：

鐵對照溶液或其與不含健康食品之基礎飲食的組合，含鐵量與實驗組相當，除了不含健康食品之外，基礎飲食之組成與特性應與實驗組相近，另外加入ascorbicacid，使莫耳數比例ascorbate：

Fe=20：

1。

（3）實驗組：

健康食品或含健康食品之飲食，鐵量與控制組相當。

健康食品若添加含鐵成分，應符合我國「食品衛生管理法」、「食品添加物使用範圍與用量標準」等相關法規。

每次實驗各種處理至少應有二重複，每個實驗至少重複兩次。

體外法必須小心控制的條件是pH值、酵素活性與反應時間，圖一為透析法的實驗流程。

測試樣品若為液態則可直接使用，若為固型物則需加入適量去離子水，以研磨機將樣品均質成乳狀「樣品漿」，紀錄樣品與水之比例與重量。

模擬胃液消化反應樣品液或「樣品漿」以6NHCl調為pH2，每100g樣品液加入5mL胃蛋白酶溶液，於37℃下震盪反應2小時而得「胃消化物」，取20g供酸度滴定之用，其餘暫時冰凍保存以待下一步模擬小腸消化反應與鐵定量之用。

酸度滴定目的是定量「胃消化物」加上「胰液」後，欲使混合物酸鹼度達到小腸環境之pH7.5，所需之KOH當量數。

對20g的胃消化物加入5mL的胰液，混合均勻後，以0.5NKOH滴定至pH7.5，紀錄所需KOH當量數，換算為NaHCO3量。

模擬小腸消化反應準備透析袋，利用酸度滴定結果，將中和所需之NaHCO3溶於25mL去離子水，裝入透析袋中，袋口夾緊毋使滲漏以備用。

將冰凍之「胃消化物」解凍，以20g為單位秤取分裝，分別置於100ml燒杯中，然後將透析袋置入燒杯中，加蓋，於37℃下震盪反應30分鐘，使鹼度升高到pH5，然後加入5mL「胰液」，繼續反應2小時。

結束時，取出透析袋，以去離子水和緩地沖洗其外部以去除消化物之干擾後，倒出袋中透析液，收集於塑膠離心管或玻璃瓶中，紀錄體積後，供可透析鐵之定量分析。

5.分析項目與方法

樣品總鐵量分析剩餘「胃消化物」秤取適量，經灰化處理後，灰份以濃HCl溶解完全，經適當稀釋後，以比色法或原子吸收光譜儀配合鐵標準溶液與標準檢量線而定量。

灰化反應需嚴防鐵污染，所需容器必須浸泡酸液後充分清洗方可使用。

可透析鐵量分析取定量透析液，加入蛋白質沉澱劑（沉澱劑：

透析液＝1：

2，v/v），充分混合後，於沸水浴中加熱10分鐘，4000×g離心10分鐘去除蛋白質沉澱。

取上清液置於試管中，加入鐵呈色劑（上清液：

鐵呈色劑=1：

1,，v/v），反應10分鐘後，測定波長535nm吸光值，比對鐵標準檢量線求出濃度。

鐵標準檢量線以鐵標準溶液（線性範圍0.5-4ppm）經相同之鐵呈色定量步驟，測得吸光值後而製作。

上清液若經適當消化分解有機物質後，也可以採用原子吸收光譜儀測定其鐵量。

6.計算

各組之「可透析鐵」以下列公式計算，並以百分比（%）表示：

每次實驗各種處理至少應有二重複，每個實驗至少重複兩次。

若各次實驗之間沒有顯著差異，則實驗結果可以合併以計算可透析鐵比例之平均值與標準偏差，並以標準偏差對平均值之百分率代表該分析之變異係數（coefficientofvariation,CV）。

測試樣品「鐵可用率」以實驗組之「可透析鐵」比例平均值對控制組之「可透析鐵」比例平均值之百分率表示。

正對照組之「鐵可用率」以該組之「可透析鐵」比例平均值對控制組之「可透析鐵」比例平均值之百分率表示。

7.結果評定

促進鐵吸收之判斷標準為實驗組之「鐵可用率」大於100%+2×CV﹙實驗組﹚，表示有促進鐵吸收之性質，可用率數值越高越好，以超過ASC組者為最優；「鐵可用率」小於100%-1×CV﹙實驗組﹚者表示測試樣品可能有抑制鐵吸收之性質。

測試樣品+去離子水

均質成乳狀樣品漿

液態樣品

以HCl調整酸度

pH2樣品漿

胃液消化反應2hr,37℃

胃消化物

置入透析袋

反應30min,37℃

酸度滴定

求得中和所需NaHCO3用量

樣品總鐵量分析

加入胰液，消化反應2hr,37℃

取出透析袋，

收集透析液，

紀錄體積

透析液

可透析鐵定量

比色定量分析

鐵可用率

評定與比較

圖一體外消化透析法評定鐵可用率之實驗流程圖

（二）體外消化—Caco-2細胞攝鐵實驗：

簡稱「細胞實驗」（22-32）

1.儀器設備

二氧化碳細胞培養箱（CO2incubator）與細胞培養操作之基本設施、迴轉式震盪器、原子吸收光譜儀或同類儀器、酵素免疫分析儀（ELISAreader）。

2.主要器材

75-cm2培養瓶或培養皿（cultureflaskorculturedish）、彈性矽膠帶（siliconring）、collagen處理之六槽細胞培養盤（collagentreated6-wellsculturedish）、塑膠離心管、透析膜MWCO12,000-14,000（12-14K,Spectra/Por），使用前以去離子水浸泡12hr。

細胞培養盤內槽（Transwellinsertring），使用前槽底外部覆以透析膜（圖二），用彈性矽膠帶固定，以70%酒精殺菌後，浸置於無菌水中備用。

實驗用玻璃器皿均應以酸液浸泡，經去離子水沖淨，去除鐵之污染後方可使用。

3.藥品與試藥

細胞培養基：

MinimumEssentialMedium（MEM），配方中不含外加鐵，鐵濃度不可超過8μg/L

細胞生長培養液（growthmedium）﹕簡稱「生長液」，供細胞增生與維持之用，組成分含有：

DMEM（Dulbecco’sModifiedEagleMedium）、

10%（v/v）FBS（fetalbovineserum）、25mmol/LHEPES、1%antibiotic-antimycoticsolution

MEM營養液：

攝鐵反應之細胞培養液，使用時新鮮配製，以MEM為溶劑，並加入：

10mmol/LPIPES、1%antibiotic-antimycoticsolution、hydrocortisone（4mg/L）、insulin（5mg/L）、sodiumselenite（5μgSe/L）、triiodothyronine（34μg/L），epidermalgrowthfactor（20μg/L）。

細胞清洗液﹕簡稱「清洗液」，於實驗開始、中途變換培養條件、實驗結束時，用來清洗細胞，以去除前段培養液的影響，組成份為：

140mMNaCl、5mMKCl、10mMPIPES（piperazine-N,N’-bis-[2-ethanesulfonicacid]）pH7.0。

除鐵溶液（ironremovalsolution）：

簡稱「除鐵液」，用來減少細胞上非專一性結合之鐵，以「清洗液」為溶劑，於使用時加入鐵螯合劑等其他成分，組成份除了「清洗液」之外，加入：

1mMbathophenanthrolinedisulfonicacid（BPDS）、5mMsodiumhydrosulfite。

EBSS/MES溶劑：

使用時新鮮配製，組成份為：

Earle’sbalancedsaltsolution（EBSS）、10mMMES（2-[4-morpholino]-ethanesulfonicacid）bufferpH6.0。

鐵對照溶液：

供攝鐵實驗中控制組之用，含有EBSS/MES溶劑與10-100μmol/LFeSO4。

正對照組溶液（ASC）：

供攝鐵實驗中正對照組之用，含有EBSS/MES溶劑、10-100μmol/LFeSO4、ascorbicacid﹙對Fe莫耳比例為20：

1﹚。

負對照組溶液（NTA）：

供攝鐵實驗中負對照組之用，含有EBSS/MES溶劑、10-100μmol/LFeSO4、nitrilotriaceticacid﹙對Fe莫耳比例為5：

1﹚。

體外消化用藥品及試劑與體外消化透析法所用相同

其他試劑有市售鐵蛋白酵素免疫分析試劑組（FerritinELISAkit）、Bio-RadDCprotein試劑等

4.細胞株來源與培養條件：

Caco-2細胞株可購自新竹食品工業研究所或美國ATCC（AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD）。

細胞培養於生長液中，接種密度為5.6×103cells/cm2，或1.68×104cells/mL。

二氧化碳培養箱之氣體條件為5%CO2/95%air，維持飽和溼度，每三天更新生長液。

細胞增生至80-100%滿盤（confluency）時可進行繼代培養（subculture）。

繼代培養時，以trypsin-EDTA處理使細胞脫離盤底，離心收集，計數細胞數目，調整濃度至接種密度以進行培養。

5.攝鐵實驗用細胞準備：

取80-100%滿盤的Caco-2細胞，以trypsin-EDTA處理收集，用生長液將細胞密度調為5×104cells/cm2或1.65×105cells/mL，置入六槽培養盤，每2天更新一次生長液，於12-14天後細胞增生達到90~100%滿盤，即可開始攝鐵實驗。

此時細胞間生成緊密的構造（tightintercellularjunctions），使物質無法從細胞間隙通透，而必須從細胞膜攝入。

6.試驗樣品之處理

視健康食品的物性而定，若健康食品為液態，並且不需要消化即可吸收，則直接進行細胞攝鐵實驗。

若健康食品為固態，或必須經過消化後方能發揮作用或吸收，則需進行下述之消化反應：

取適量食品與120mmol/LNaCl溶液混合均質，使均質液之蛋白質濃度約為0.5mg/10mL，並以6NHCl調整至pH2後，取10mL均質液加入「胃液」0.5mL，置於塑膠離心管中，加蓋後水平放置，於37℃下震盪反應1小時而得「胃消化物」，然後以1mol/LNaHCO3逐滴加入以調整其酸鹼度達pH6.0，加入2.5mL「胰液」，以NaOH調整至pH7.5，最終體積以120mmol/LNaCl溶液定容為15mL，暫稱為「待消化物」，立即用於細胞攝鐵實驗，實驗流程如圖二所示。

7.實驗設計及步驟

每次攝鐵試驗應包含以下組別：

（1）控制組：

以鐵控制溶液替代實驗樣品，可依需要採用單一鐵量或系列鐵量。

（2）正對照組：

以ASC溶液替代實驗樣品，可依