血红蛋白的提取和分离.docx

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血红蛋白的提取和分离

波峰中学高二生物理班课前双基预习案A（课前）

班级：

____姓名：

____编制:

陈芳审核：

赵玉春审定：

编号：

专题五DNA和蛋白质技术

课题3血红蛋白的提取和分离（第1课时）

【学习目标】

1.熟记凝胶色谱法、电泳法分离生物大分子的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；

2.掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。

【完成目标】

目标一原理

提取和分离蛋白质的原理：

蛋白质的各种特性的差异：

如分子的、所带的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的等，由此提取和分离各种蛋白质。

（1）凝胶色谱法

1.凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。

2.原理：

相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。

相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

3.具体过程：

A．的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；

的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。

B．

（1）蛋白质混合物；

（2）开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；

（3）相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质移动。

（4）不同的蛋白质分子完全分开；

（5）的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，的蛋白质还在行进中。

（二）缓冲溶液

1．缓冲溶液的作用：

在一定范围内，缓冲溶液能够抵制对溶液pH的影响，而保持。

2．缓冲溶液通常由1～2种溶解于水配制而成。

调节可以制成在不同pH范围内使用的缓冲液。

【思考1】维持人体血液pH稳态的缓冲对有。

（三）电泳

1.概念：

电泳是指在的作用下发生的过程。

2.原理：

许多重要的生物大分子，如等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其移动。

3.在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子，决定带电分子迁移快慢的是带电分子、电量的不同。

4.常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。

为了消除样品分子原有净电量对迁移速率的影响，可以在凝胶中加入，使样品分子的迁移速率完全取决于。

波峰中学高二生物课后限时作业B

基础题

1、下列有关叙述错误的是（）

A．用醋酸菌制作果醋时，需通入氧气

B．利用凝胶色谱法可分离相对分子质量不同的蛋白质

C．进行DNA粗提取时，用酒精提取含杂质较少的DNA

D．接种前需对培养基、培养皿、实验操作者的双手等进行灭菌处理

2、关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是（）

A．分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来

B．抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂

C．蛋白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质

D．蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物

3、下列有关生物技术实验的叙述，正确的是（）

A．制作果酒和制作果醋所需的发酵底物、适宜温度等均相同

B．在植物组织培养过程中，制备的MS培养基需要用酒精消毒

C．用二苯胺鉴定DNA和用斐林试剂检测还原糖时均需要水浴加热

D．用凝胶色谱法分离蛋白质时，与分子量较小的蛋白质相比，血红蛋白移动较慢

4、下图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质，在凝胶中的行进过程的是（　　）

5、下列对红细胞和血红蛋白的描述，错误的是（　　）

A．哺乳动物成熟的红细胞可用于制备细胞膜和提取血红蛋白的生物材料

B．血红蛋白属于细胞外液的成分，其组成元素有C、H、O、N、Fe

C．血红蛋白的纯化可用凝胶色谱法，其原理是根据相对分子质量大小分离蛋白质

D．蛙的红细胞可进行无丝分裂，其特征是没有出现纺锤丝和染色体的变化

6、在血红蛋白的提取过程中，要使用磷酸缓冲液处理的作用是（　　）

A.防止血红蛋白被氧气氧化

B.血红蛋白是一种碱性物质，需磷酸中和

C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程

D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和性质

7、下列关于提取和分离蛋白质的步骤正确的是（　　）

A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

8、利用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是（　　）

A．蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小

B．蛋白质相对分子质量的大小

C．蛋白质所带电荷的多少

D．蛋白质溶解度的大小

9、用凝胶色谱法分离相对分子质量小的蛋白质时，下列说话正确的是（　　）

A．路程较长，移动速度较慢

B．路程较长，移动速度较快

C．路程较短，移动速度较慢

D．路程较短，移动速度较快

10、凝胶常在分离蛋白质时使用，其的种类很多，但都有相同的作用是（　　）

A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径

B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度

C．将酶或细胞固定在凝胶中

D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度

11、下列对样品的加入以及洗脱的操作错误的是（　　）

A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶柱内

C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D．用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

12、下列提纯猪血红蛋白的叙述错误的是（　　）

A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂

B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少

C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测

D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢

13、为了探究啤酒酵母固定化的最佳条件，科研人员研究了氯化钙浓度对固定化酵母发酵性能的影响，结果如图。

请回答：

（1）与利用游离酵母生产啤酒相比，利用固定化酵母的优点有_________________________________________________________

________________________________________________________________________。

（2）本实验结果表明，随氯化钙浓度的增大，凝胶珠机械强度增大，完整率________。

（3）结合发酵性能分析，制备凝胶珠适宜的氯化钙浓度为________。

当氯化钙浓度过高时，发酵液中的糖度升高，酒精度下降，发酵受到影响，原因是______________________________________________

________________________________________________________________________。

（4）用海藻酸钠作为载体包埋酵母细胞，溶解海藻酸钠时最好采用________的方法，以防发生焦糊。

溶化好的海藻酸钠溶液应________后，再与已活化的酵母细胞充分混合。

若海藻酸钠浓度过低，会导致________，固定效果大大降低。

波峰中学高二生物理班课前双基预习案A（课前）

班级：

____姓名：

____编制:

陈芳审核：

赵玉春审定：

编号：

专题五DNA和蛋白质技术

课题3血红蛋白的提取和分离（第2课时）

【学习目标】

1.熟记凝胶色谱法、电泳法分离生物大分子的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；

2.掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。

【完成目标】

目标二实验操作

蛋白质的提取和分离的一般分为四步：

、、和。

（一）样品处理及粗分离

1.红细胞的洗涤洗涤的目的是去除，以利于后续步骤的分离纯化。

为防止血液凝固，应预先加入；所用洗涤液是倍于红细胞液的；洗涤中用玻璃棒，用离心机离心；洗涤干净的标准是。

2.血红蛋白的释放：

在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

3.分离血红蛋白溶液：

将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:

第1层（最上层）：

甲苯层

第2层（中上层）：

的沉淀层，色薄层固体

第3层（中下层）：

的水溶液层，的液体

第4层（最下层）：

其它杂质的沉淀层

将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即溶液。

4.透析将血红蛋白溶液装入中，放入中透析12h。

透析的目的是除去血红蛋白溶液中的物质。

（二）凝胶色谱操作

1.第一步要制作，第二步要，因为，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。

在装填凝胶柱时，不得有存在。

第三步是。

2.

（1）凝胶的选择：

。

（2）方法：

配制凝胶悬浮液：

计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。

（3）凝胶色谱柱的装填方法

1固定：

将色谱柱垂直固定在支架上

②装填：

将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。

③洗涤平衡装填完毕后，用充分洗涤平衡12h，使凝胶装填。

3.样品加入与洗脱

（1）加样前：

打开下端流出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口。

（2）加透析样品：

用吸管沿将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏。

（3）洗脱和收集：

打开下端，用磷酸缓冲液洗脱，待接近色谱柱时，用试管收集流出液，

（三）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度

三、操作提示

1．红细胞的洗涤时，洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。

洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高或离心时间过长，会使等一同沉淀。

2．为了加快凝胶膨胀，可以将加入的湿凝胶用加热，不仅节约时间，还能除去凝胶中的和。

3．凝胶色谱柱中不能存在气泡，原因是气泡会，降低分离效果。

思考2：

你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：

样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。

【当堂检测】

请将下列实验流程图补充完整：

波峰中学高二生物课后限时作业B

基础题

1、使用SDS—聚丙烯酰胺电泳的过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（　）

A.电荷的多少B.分子的大小

C.肽链的多少D.分子形状的差异

2、下列关于提取和分离蛋白质的步骤正确的是（　　）

A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

3、凝胶常在分离蛋白质时使用，其的种类很多，但都有相同的作用是（　　）

A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径

B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度

C．将酶或细胞固定在凝胶中

D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度

4、下列对样品的加入以及洗脱的操作错误的是（　　）

A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶柱内

C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D．用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

5、下列对凝胶色谱柱相关操作过程正确的是（）

A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴

B.将橡皮塞下部用刀切出凹穴

C.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面

D.将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片

6、使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的相对分子质量。

下列说法不正确的是（）

A.SDS能与蛋白质形成复合物而掩盖不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率取决于分子的大小

B.与已知相对分子质量的标准蛋白的电泳带相等，只能估计出待测蛋白质的相对分子质量

C.SDS在引发剂和催化剂的作用下参与构成聚丙烯酰胺凝胶

D.如果只是分离混合物而不需要测定蛋白质的相对分子质量时，就无需加入SDS，此时的电泳迁移率取决于所带电荷和分子的大小

7、将经处理破裂后的红细胞混合液以2000r/min的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是（）

A.血红蛋白、甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、沉淀层

B.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、其他杂质的暗红色沉淀物

C.其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、甲苯层、沉淀层

D.甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、沉淀层

提高题

8、下列关于血红蛋白的提取和分离实验操作正确的是（）

A.分离红细胞时采用低速长时离心

B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水即可

C.分离血红蛋白溶液是低速短时离心

D.透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h

9.凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。

①凝胶色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的不同而实现分离的：

②使用电泳法分离蛋白质．是利用了待分离样品中各种分子的差异，以及分子本身的、形状的不同。

10.红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：

（1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：

______、______、______和______。

（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①加入柠檬酸钠的目的是__________________。

②以上所述的过程即是样品处理，它包括______、______、收集血红蛋白溶液。

（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是__________________。

②透析的原理是______________________________。

（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是______________________________。

②血红蛋白有什么特点？

______________________________。

这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？

______________________________________________________。

参考答案

一、单项选择

1、【答案】D

2、【答案】C

3、【答案】C

4、【答案】B

5、【答案】B

6、【答案】D

7、【答案】C

8、【答案】B

9、【答案】A

10、【答案】A

11、【答案】A

12、【答案】D

二、非选择题（必修）

三、非选择题（选修）

13、【答案】

（1）可多次使用、便于产物分离、提高产品质量等

（2）增加

（3）2.0mol/L　凝胶珠机械强度过大，通透性降低，影响糖进入颗粒内部

（4）小火或间断加热　冷却至室温　酵母细胞从颗粒中漏出

14、【答案】

（1）去除血浆蛋白

（2）离心后的上清液没有黄色

（3）低速如500r/min，短时间如2min

（4）离心速度过高或时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提纯

一、单项选择

1、【答案】B

2、【答案】C

3、【答案】C

4、【答案】A

5、【答案】A

6、【答案】A

7、【答案】C

8、【答案】B

9、【答案】D

10、【答案】A

二、非选择题（必修）

三、非选择题（选修）

11、【答案】

（1）生理盐水　渗透原理（当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破）

（2）除去小分子杂质　增加缓冲液的量或及时更换缓冲液

（3）带电性质以及分子大小、形状

（4）2　携带者具有（控制血红蛋白的）一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质

12、【答案】

（1）防止血液凝固　

（2）红细胞的洗涤　小分子可以自由进出透析袋（半透膜），而大分子不能通过　（3）大小　带电性质　分子的大小　（4）丙