营养强化剂的通用名称功能分类用量和使用范围.docx
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营养强化剂的通用名称功能分类用量和使用范围
一、营养强化剂的通用名称、功能分类，用量和使用范围
1.1.通用名称：
中文名称：
低聚半乳糖
英文名称：
Galactooligosaccharides（GOS）
1.2.功能分类：
营养强化剂
1.3.用量和使用范围：
食品分类号
食品类别名称
添加量（g/kg）
13.01
婴幼儿配方食品
单独或混合使用，该类物质总量不超过64.5g/kg
13.02.01
婴幼儿谷类辅助食品
二、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件
母乳是婴儿的最佳的营养品，它可为婴儿提供均衡的营养，以满足出生后婴儿生长所需。
母乳低聚糖（HMOs）就是母乳中有益健康的有效成分之一。
母乳与婴儿配方食品的成分有明显差异。
其中一个显著区别是母乳中确定含有超过100多种的低聚糖（HMOs），而这些低聚糖在婴幼儿配方食品中不是不存在就是没有达到有生理意义的水平。
母乳中不消化的低聚糖，其功能是多元化的，其中包括在形成婴儿肠道微生物菌群组成方面起重要作用。
HMOs已被证明可刺激和促进母乳喂养婴儿体内主要的有益肠道微生物菌群的增长，尤其是双歧杆菌和乳酸杆菌。
已证明牛奶中含有多种低聚糖，其中一些的结构与母乳中发现的低聚糖相同或相近。
最新进展是将乳清滤出液作为生产低聚半乳糖的原料来源。
乳清滤出液由乳糖、牛奶低聚糖，如3’-和6’-唾液乳糖（在母乳中也存在）和少量的其他成分组成。
乳清滤出液中的乳糖在酶的作用下转化为GOS。
在婴儿配方食品中添加GOS，使其低聚糖模式比不添加GOS的婴儿配方食品更接近母乳。
补充含有GOS的婴儿配方食品，对婴儿配方食品喂养的婴儿有功能性益处，例如使婴儿粪便变软、肠道微生物菌群生长，从而更接近母乳喂养的婴儿。
拟申报的GOS以牛奶（乳清滤出液）为原料，与其他的GOS来源类似。
它还含有少量的天然牛奶成分，包括另外两种低聚糖：
3’-唾液乳糖和6’-唾液乳糖。
这两种低聚糖是母乳本身的成分。
按照母乳每日摄入量0.8L估计，母乳喂养婴儿每天将摄取4-12g人乳低聚糖。
由添加拟申报GOS达到的总低聚糖含量水平为5.88g/100g奶粉（大约为8g/L），符合母乳低聚糖含量范围。
如果按照婴儿配方食品相同的每日摄入量0.8L估计，则婴儿每日可从GOS获取6.4g的低聚糖总量。
临床试验对在婴儿配方粉中添加拟申报GOS进行了评估，并列于申报材料中。
婴儿摄入含有拟申报GOS5.88g/100g婴儿配方粉（约8g/L）是安全的，且表现出良好的耐受性，同时可以促进婴儿的健康生长。
摄入试验配方粉的婴儿和摄入母乳的婴儿的排便频次、粪便硬度和酸度相似。
另外含有拟申报GOS的婴儿配方粉，通过增加双歧杆菌和乳酸杆菌的水平，促进形成健康的微生物菌群，从而使其更接近母乳喂养婴儿。
三、质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或者相关情况说明
3.1质量规格
3.1.1标准文本
食品安全国家标准
营养强化剂低聚半乳糖
1.范围
本标准适用于以乳清滤出液为原料，经米曲霉（Aspergillusoryzae）生产的β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键，将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，同时通过转移半乳糖苷的作用，将水解下来的半乳糖苷转移到乳糖分子，制得的营养强化剂低聚半乳糖。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3.技术要求
3.1感官要求
感官要求应符合表1的规定。
表1感官要求
项目
指标
检验方法
色泽与状态
白色或微黄色粉末
取适量试样置于清洁、干燥的白瓷盘或烧杯中，在自然光线下，观察其色泽和状态，并嗅（品）其味
气味
无异味
滋味
味甜
3.2理化指标：
理化指标应符合表2的规定。
表2理化指标
项目
指标
检验方法
总低聚糖含量（以干基计）,w/%
≥
46
附录A.2
乳糖含量（以干基计）,w/%
20–40
经计算得出*
葡萄糖含量（以干基计）,w/%
≤
10
附录A.3
半乳糖含量（以干基计），w/%
≤
5
附录A.3
唾液乳糖含量（以干基计），w/%
≥
0.2
附录A.4
蛋白质（N*6.38）（以干基计），w/%
≤
4.47
凯氏定氮法
水分,w/%
≤
5.5
GB/T20884
灰分（以干基计）,w/%
≤
4
GB5009.4
pH（10%溶液）
5-6
GB/T20885
铅（以Pb计）/（mg/kg）
≤
0.1
GB5009.12
*乳糖含量=100–总低聚糖含量–葡萄糖含量–半乳糖含量–灰分–蛋白质
3.3微生物指标
微生物指标应符合表3的规定。
表3微生物指标
项目
指标
检验方法
菌落总数/（CFU/g）
≤
3,000
GB4789.2
大肠菌群（/CFU/g）
≤
10
GB4789.3
霉菌/（CFU/g）
≤
50
GB4789.15
酵母菌/（CFU/g）
≤
50
GB4789.15
金黄色葡萄球菌/25g
不得检出
GB4789.10
沙门氏菌/25g
不得检出
GB4789.4
附录A
检验方法
A.1一般规定
本标准除另有规定外，所用试剂纯度均为分析纯，所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备。
本标准所用水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。
试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。
A.2总低聚糖含量的测定
A.2.1方法提要
在邻氨基苯甲酸酰胺标记后，利用内标法确定不同低聚糖的摩尔浓度，通过不同低聚糖的分子量，将摩尔浓度换算为质量浓度进行定量。
A.2.2试剂和材料
A.2.2.1二甲亚砜，纯度>99.9%
A.2.2.2邻氨基苯甲酸酰胺，纯度>98%
A.2.2.3氰基硼氢化钠，纯度>95%
A.2.2.4甲酸纯度：
98-100%
A.2.2.5乙腈，纯度>99%
A.2.2.625%氢氧化铵溶液
A.2.2.7昆布三糖，纯度>90%
A.2.2.8麦芽三糖，纯度>95%
A.2.2.9无水乙酸，纯度：
100%
A.2.2.10麦芽三糖标准储备液：
3.0µmol/mL
称取75.0±5.0mg麦芽三糖（A.2.2.8），精确到0.1mg。
在50mL容量瓶中用40mL水溶解，加水定容至刻度。
此溶液可在4°C下存放一周。
A.2.2.11麦芽三糖标准工作液：
0.30µmol/mL
用移液枪量取10.0mL麦芽三糖标准储备液（A.2.2.10）到100mL容量瓶中，加水定容至刻度。
此溶液可在4°C下存放1周。
A.2.2.12昆布三糖内标标准储备液：
2.0µmol/mL
定量移取50mg昆布三糖（A.2.2.7）和大约15mL水至50mL容量瓶中，加水定容至刻度。
此溶液可在-18°C下存放1年。
A.2.2.13昆布三糖内标标准工作液：
0.4µmol/mL
用移液枪移取4mL昆布三糖储备液（A.2.2.12）至20mL容量瓶中，加水定容至刻度。
此溶液可在-18°C下存放1年。
A.2.2.14水-乙腈（25%-75%）溶液
称取50±1mL水和150±1mL乙腈（A.2.2.5）放入玻璃瓶中混合。
此溶液可在室温下存放3个月。
A.2.2.15洗脱液B：
甲酸铵，50mmol/L，pH4.4
在盛有800mL水的烧杯中加入2.3g±0.1g（1.89mL）甲酸（A.2.2.4）。
用氢氧化铵（A.2.2.6）调节pH至4.40±0.05。
将溶液移入1000mL容量瓶中，加水定容至刻度。
此溶液可在室温下存放1周。
A.2.2.16邻氨基苯甲酸酰胺标记试剂：
邻氨基苯甲酸酰胺[0.35mol/L]-氰基硼氢化钠[1.0mol/L]二甲亚砜-乙酸[30%]溶液。
根据实验中需要测定的最大样品数量，用移液枪移取相应量的二甲亚砜（A.2.2.1）和乙酸（A.2.2.9），放入10mL玻璃管中使用涡旋混合器充分混合（参照表A.1），。
按表A.1准确称取相应质量的邻氨基苯甲酸酰胺和氰基硼氢化钠，放入玻璃管中，随后加入含有30%乙酸的二甲亚砜通过使用涡旋混合器混合并使用超声波清洗机直至完全溶解。
（约10min）
表A.1:
邻氨基苯甲酸酰胺标记试剂样品量
最大检测数
含30 %乙酸的二甲亚砜
邻氨基苯甲酸酰胺（0.35M）和氰基硼氢化钠（1M）
溶于含30 %乙酸的二甲亚砜
二甲亚砜（mL）
乙酸
（mL）
含30 %乙酸的二甲亚砜（mL）
邻氨基苯甲酸酰胺（mg）
氰基硼氢化钠（mg）
11
2.10
0.90
2.50
118±5
157±5
22
4.20
1.80
5.00
236±10
314±10
35
6.30
2.70
7.50
354±10
471±10
47
7.70
3.30
10.00
708±10
942±10
A.2.3仪器和设备
A.2.3.1高效液相色谱仪配备荧光检测器。
A.2.3.2带有自锁的2mL离心管
A.2.3.3微型管架
A.2.3.4离心机
A.2.3.5水浴或加热平板
A.2.3.6涡旋混合器
A.2.3.7移液枪
A.2.3.8分析天平：
精度0.1mg。
A.2.3.9超声波清洗机
A.2.4色谱参考条件
A.2.4.1色谱柱：
TOSOH，Amide803µm;4.6mmx150mm，或其他等效色谱柱。
A.2.4.2预分离柱：
Amide80保护柱；3µm;3.2mmx15mm
A.2.4.3柱温23°C±2°C
A.2.4.4进样量：
10µL
A.2.4.5流动相A：
乙腈（A.2.2.5）
A.2.4.6流动相B：
甲酸铵（A.2.2.15）
A.2.4.7梯度洗脱：
洗脱程序参见表A.2。
表A.2洗脱程序表
时间（min）
流速（mL/min）
流动相
10位6通阀切换位置
%A
%B
0
1.0
98
2
6/10-1（上样）
4.0
1.0
98
2
6/10-1（上样）
7.5
1.0
98
2
1-2（分析）
8.0
1.0
84
16
1-2（分析）
16.0
1.0
84
16
1-2（分析）
50.0
1.0
61
39
1-2（分析）
51.0
0.80
20
80
1-2（分析）
54.0
0.80
20
80
1-2（分析）
55.0
0.80
90
10
1-2（分析）
61.0
1.0
90
10
1-2（分析）
A.2.4.8激发波长：
330nm
A.2.4.9发射波长：
420nm
A.2.5分析步骤
A.2.5.1样品与溶液的制备
A.2.5.1.1试验溶液的制备
准确称取0.250±0.050g低聚半乳糖放入容量瓶中，加70±5mL水。
将容量瓶置于70±5°C水浴中20至25min并搅拌。
将溶液冷却至室温，加水定容至刻度。
A.2.5.1.2空白试剂
在每个系列的检验中，向500µL水中加入标记物，代替试验样品作为空白试剂。
A.2.5.1.3邻氨基苯甲酸酰胺标记
A.2.5.1.3.1添加内标物
用移液枪量取500µL试验溶液（A.2.5.1.1）或麦芽三糖工作液溶液（A.2.2.11）至2mL微型管中，随后向每个样品或标准液中加入200µL昆布三糖内标标准工作液（A.2.2.13），在漩涡混合器上进行混合。
A.2.5.1.3.2邻氨基苯甲酸酰胺试剂的添加
量取20µL含有内标物的试验溶液（A.2.5.1.3.1）放入2mL微型管中，向每个微型管中加入200µL邻氨基苯甲酸酰胺标记试剂（A.2.2.16），在漩涡混合器上进行混合，随后置于65±1°C水浴中反应2h±5min。
每隔20分钟，漩涡混合一次。
反应两小时后，混合试验溶液，并放置于4°C环境下至少10min。
A.2.5.1.4样品稀释。
在进行邻氨基苯甲酸酰胺标记后，向每个微型管中加入1.5mL水-乙腈25-75溶液（A.2.2.14）。
混合（旋涡混合）后在10000g下离心5min，随后移取1mL上清液至进样瓶中。
将进样瓶置于自动进样器中（10°C），进样10µL标准溶液和试验样品。
A.2.5.2仪器稳定性测试
使色谱系统在初始条件下平衡15分钟。
确保基线和系统压力在开始检验前保持稳定，在开始试验前，至少进样一次参照样品或标准工作溶液。
检查保留时间、分离与前次试验比较。
通过检验不同浓度的麦芽三糖-邻氨基苯甲酸酰胺标准溶液的响应系数，检查荧光检测器在整个量程内的线性响应。
A.2.5.3校准
在每一个分析序列中，两次重复测定含有与测试样品相同内标物（
的麦芽三糖标准溶液。
至少每8个测试样品之间需要重新进样标准品，。
以
的平均值为Y轴，标准溶液摩尔浓度（
）为X轴，来绘制通过原点的内标法校准曲线。
利用麦芽三糖标准曲线的响应系数，定量每一个确定色谱峰（或色谱峰组）在色谱图中的摩尔浓度。
A.2.5.4鉴定和确认
积分和定性每一个色谱峰（或具有相同分子量的色谱峰组）。
通过与参考液相色谱图进行比较，确定不同色谱峰的分子量。
A.2.6结果计算
A.2.6.1低聚糖的摩尔浓度
试样中低聚糖的摩尔浓度
，数值以µmol/mL表示，按式（A.1）计算
式中:
Cstd:
标准溶液中麦芽三糖的浓度，单位：
µmol/mL
Amt_ISsple:
样品测试中加入昆布三糖内标溶液的量
Amt_ISstd:
标准测试中加入昆布三糖内标溶液的量
A_OSsple:
进样样品中低聚半乳糖的峰面积
A_std:
标准液中麦芽三糖的峰面积
A_ISsple:
进样样品中内标的峰面积
A_ISstd:
标准液中内标的峰面积
V:
样品的体积，单位mL
msple:
试验样品的质量。
单位mg。
A.2.6.2总低聚糖的质量分数
总低聚糖的质量分数（W），以g/100g计，按式（A.2）计算:
式中:
Ʃ:
求和
Cos.:
测试样品中低聚糖的摩尔浓度。
单位：
µmol/g。
按式（A.1）计算。
M:
不同分析物的摩尔质量
0.0001:
µg/g到g/100g的转换系数
A.2.7结果的表达
结果以低聚半乳糖或者包括二糖和不包括二糖的总低聚糖表示。
如果检验值高于1.00g/100g，总低聚糖的结果（g/100g）保留3位有效数字。
如果检验值低于1.00g/100g，总低聚糖的结果（g/100g）保留2位有效数字。
A.2.8精确性
同一操作员在相同实验室内采用相同设备，在较短时间间隔内对相同实验材料进行的两次独立单一试验测得的结果之间的绝对差值不超过样品不超过0.65g/100g。
A.3葡萄糖和半乳糖含量的测定
A.3.1方法提要
用热水提取糖，注入HPAEC-PAD系统进行分析。
糖在强碱性条件下部分电离，然后用阴离子交换色谱聚合柱分离。
通过测量糖在金电极表面发生氧化反应所产生的电流，进行计算分析。
柱后加碱可以增加检测器灵敏度和线性范围，以及稳定基线。
A.3.2试剂和材料
A.3.2.1氢氧化钠溶液，5mol/L
A.3.2.250%氢氧化钠溶液
A.3.2.3无水乙酸钠，纯度>99%
A.3.2.4D-乳糖一水合物，纯度>99.5%
A.3.2.5D-（+）-无水葡萄糖，纯度>99.5%
A.3.2.6D-（+）-半乳糖，纯度>99.0%
A.3.2.7甲醇
A.3.2.8氦气，纯度>99.996%
A.3.2.9含有指示剂的硅胶
A.3.2.10氢氧化钠溶液：
0.05mol/L
用移液枪量取10.0mL5.0mol/L氢氧化钠溶液（A.3.2.1），至1000mL容量瓶中，加水定容至刻度。
用聚乙烯瓶盛装保存于室温下，可稳定保存长达6个月。
A.3.2.11洗脱液A：
氢氧化钠溶液：
300Mm/L
用1000mL量筒量取985mL去离子水，注入仪器储液罐A中，用氦（A.3.2.8）脱气20min。
用一次性塑料移液管加入15.6mL50%（w/w）氢氧化钠溶液（A.3.2.2），缓慢涡旋混合。
用氦（A.3.2.8）喷洒15min。
在室温下用氦（34.47kPa–55.16kPa）封闭保存。
该溶液可保存4天。
A.3.2.12洗脱液B：
去离子水
量取2000mL去离子水，注入仪器储液罐B，用氦（A.3.2.8）脱气20min。
该洗脱液须在使用当天配制，用氦（34.47kPa–55.16kPa）封闭保存。
A.3.2.13洗脱液C：
氢氧化钠：
150mM，乙酸钠：
500mM
称取41.0±0.1g无水乙酸钠（A.3.2.3），置于1000mL容量瓶中，用800mL水溶解并混匀。
加水定容至刻度，经0.20µm尼龙膜滤器过滤至仪器储液罐C中。
用氦（A.3.2.8）脱气20min。
用一次性塑料移液管加入7.8mL50%氢氧化钠溶液（A.3.2.2）。
缓慢涡旋混合，然后再用氦（A.3.2.8）喷洒15min（A.2.2.13）。
在室温下用氦（34.47kPa–55.16kPa）封闭保存。
该溶液可保存4天。
A.3.2.14柱后试剂，氢氧化钠：
300mM
用量筒准确量取985mL水，注入柱后储液罐中。
用一次性塑料移液管加入15.6mL50%（w/w）氢氧化钠溶液（A.3.2.2），缓慢涡旋混合。
该溶液可在室温下保存4周。
A.3.2.15糖标准储备液
用加塞烧瓶盛装标准溶液，保存于干燥器（置于干硅胶上方）中（A.3.2.9）。
按表A.3所列称取适量糖，置于100mL容量瓶中。
记录质量，精确至0.1mg，用水定容至刻度。
表A.3.标准储备液配制的称量方案
糖类
质量（mg）
容量瓶（mL）
浓度（mg/mL）
葡萄糖
100±5
100
1.0
乳糖（无水）
100±5
100
1.0
半乳糖
100±5
100
1.0
A.3.2.16多糖校准标准工作液
按照表A.4，通过稀释标准储备溶液制备校准溶液。
表A.4校准溶液制备方案
储备液用量
校准标准溶液中各糖组分浓度
标准溶液
葡萄糖
（µL）
乳糖
（µL）
半乳糖
（µL）
最终体积
（mL）
葡萄糖
（µg/mL）
乳糖
（µg/mL）
半乳糖
（µg/mL）
A
100
100
50
100
1.50
3.00
0.375
B
250
250
100
100
3.75
7.50
0.750
C
500
500
200
100
7.50
15.00
1.50
D
750
750
400
100
11.25
22.50
3.00
E
1000
1000
600
100
15.00
30.00
4.50
F
1250
1250
800
100
18.75
37.50
6.00
上表中所示浓度为建议值。
实际溶液浓度应通过计算并用于校准。
将溶液分装保存于-20°C，可保存12个月。
A.3.3设备和材料
A.3.3.1无金属离子干扰的惰性离子色谱，配备脉冲电化学检测器
A.3.3.2移液管
A.3.3.3真空过滤系统
A.3.3.4尼龙滤膜
A.3.3.5水浴微型管
A.3.3.6微型管
A.3.3.7离心机
A.3.3.8一次性注射器
A.3.3.9分析天平，精度为0.1mg
A.3.3.10尼龙注射式过滤器
A.3.3.11进样瓶
A.3.4色谱条件
A.3.4.1柱：
CarboPacPA20色谱柱，3×150mm，6.5µm，或其他性能相当的柱子。
A.3.4.2柱温：
30°C±2°C
A.3.4.3进样量：
25µL
A.3.4.4进样口温度：
室温或10°C（如有冷却系统）
A.3.4.5洗脱液A：
300mM氢氧化钠溶液（A.3.2.10）
A.3.4.6洗脱液B：
去离子水（A.3.2.11）
A.3.4.7洗脱液C：
氢氧化钠：
150mM，乙酸钠：
500mM（A.3.2.12）
A.3.4.8洗脱程序：
洗脱程序如表A.5所示：
表A.5.葡萄糖、乳糖和半乳糖测定的洗脱程序
时间
流速
洗脱液A
洗脱液B
洗脱液C
备注
[min]
[mL/min]
[%]
[%]
[%]
初始
0.5
2.0
98.0
0.0
0.0
0.5
2.0
98.0
0.0
开始采集信号
1.0
0.5
2.0
98.0
0.0
12.0
0.5
5.0
95.0
0.0
21.0
0.5
22.4
65.6
12.0
21.1
0.5
0.0
0.0
100.0
开始冲洗
26.0
0.5
0.0
0.0
100.0
26.1
0.5
100.0
0.0
0.0
31.0
0.5
100.0
0.0
0.0
停止冲洗
31.1
0.5
2.0
98.0
0.0
开始重新平衡
37.0
0.5
2.0
98.0
0.0
停止重新平衡
A.3.4.9柱后添加：
300mM氢氧化钠（A.3.2.14），流速0.2mL/min。
A.3.4.10检测器波形：
采用优化的脉冲电化学条件，如表A.6中所示糖的四倍波形。
表A.6.脉冲电化学检测器测得糖的四倍波形
时间[s]
电势[V]
积分
0.00
+0.1
0.20
+0.1
开始
0.40
+0.1
结束
0.41
-2.0
0.42
-2.0
0.43
+0.6
0.44
-0.1
0.50
-0.1
A.3.4.11估计保留时间：
乳糖：
18.1min；葡萄糖9.6min；半乳糖8.6min。
此仅为参考保留时间，实际保留时间会因仪器设定，色谱柱批次等因素而不同。
A.3.5分析步骤
A.3.5.1样品和试液制备
A.3.5.1.1样品准备
称取1g-10g均质试样（mS），精确至0.0001g，置于100mL（VS）容量瓶中。
A.3.5.1.2提取
加入60mL-70mL水，测量pH。
若pH<4.0，滴加50mM氢氧化钠溶液（A.3.2.1）调节pH至6-7。
置于70°C±2°C水浴中，持续搅拌下加热25min-30min。
冷却至室
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