高级技能训练分子生物学实验技术091009Word文件下载.docx

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1.eppendorf管、吸头、枪头盒、eppendorf管盒、冰盒

2.移液枪：

5-40μl、40-200μl、200-1000μl

3.手术剪刀、镊子、托盘、匀浆器

4.小鼠肝组织

（三）试剂

1.Trizol

2.氯仿、异丙醇、DEPC水

3.无水乙醇、70％乙醇：

4℃预冷

4.3mol/LNaAc

【实验步骤】

1.动物在实验前禁食8-10小时。

取100mg新鲜肝组织加1mlTRizol（预冷）试剂，于冰浴中匀浆，匀浆速度要快，使肝组织迅速接触到变性剂，避免组织内源RNA酶的污染。

然后将匀浆液转移至1.5ml离心管中，冰浴10min；

2.加入200μl（或1/5体积）的氯仿，剧烈振荡混合30s，室温2-5min，静置分层。

4℃12000rpm离心15min。

离心管中液体分为3层：

上层为水相，RNA在此相中，蛋白质在下层黄色的有机相中，DNA保留在上下两层的界面处的中间层中；

3.小心吸取上层水相约0.4ml于新的塑料离心管中（切勿吸取中间层和下层液体）。

加入1倍体积的4℃预冷的异丙醇，室温放置10min（或-20℃静置30min以上）；

4.4℃12000rpm离心15min，沉淀RNA，弃上清；

5.用1ml预冷的75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm4℃离心5min，弃尽上清.

6.重复步骤5，然后室温中自然干燥10min，至RNA呈半透明状即可；

7.根据RNA提取量加约100μlDEPC处理的水溶解沉淀，65℃水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液。

如须保存，可加0.1体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.2倍体积的冰无水乙醇，充分混匀，于-70℃低温保存。

或用稳定的甲酰胺溶解（4mg/ml）,-20℃保存，用时，4倍乙醇沉淀，回收RNA。

【RNA纯度、浓度测定及分子完整性的鉴定】

RNA是否能用于后续实验，取决于它的纯度和分子的完整性，常用的鉴定方法是测定样品260nm与280nm的光吸收值以及电泳显示RNA分子是否降解。

1.260nm/280nm光吸收比值

取10µ

L总RNA样品，加1000µ

LDEPC处理过的水，混匀，测同一样品在260nm和280nm光吸收值，以A260/A280的比值表示其纯度，比值在1.8-2.0之间为纯的RNA，比值低于1.8，说明RNA样品有蛋白质或酚的污染，需要用氯仿重新抽提。

2.RNA含量

RNA浓度（μg/ml）=A260×

40×

（1/光径）×

稀释倍数

RNA得量（μg）=RNA浓度×

最终RNA原液毫升数

RNA浓度约1-5µ

g/µ

L为宜

3.电泳鉴定（见实验二）

RNA样品（约5-10μg）经含甲醛的1.5%琼脂糖凝胶变性电泳，电泳后在紫外光激发下，RNA分子会产生桔红色荧光，如此可以观察到28S和18SrRNA两条带是否清晰，若28S的荧光强度为18S的二倍以上，则说明RNA分子没有降解。

【注意事项】

创造一个无RNase的环境，尽量减少外源RNase及组织细胞内源RNase对RNA的降解作用。

1.实验器具的预处理和配制试剂的注意点

（1）金属、玻璃器皿：

通常的高压消毒方法不能充分使RNase失活，必须将清洗烘干的玻璃器皿等，用铝铂包装好，在马福炉中300℃烘烤4hr。

（2）不能经受高温烘烤的器具如塑料管等，最好一次性使用，或在0.1%焦碳酸二乙酯（DiethylpyrocarbonateDEPC）中37℃水浴、浸泡12hr，然后经121℃（15磅）高温高压20min后，烘干使用；

DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

DEPC水经15磅高温高压处理，可分解为CO2而无害。

（3）所有试剂、器具应新包装并专用。

所有溶液用0.1%DEPC水配置（高温高压处理过）；

含Tris的试剂应用0.1%DEPC处理过的水配制（DEPC遇Tris既迅速分解为乙醇和CO2），配好后再经高温高压。

（4）实验室环境洁净，避免飞尘及携带微生物RNase污染；

为防止操做者手上、唾液的RNase对样品和试剂污染，实验中要戴一次性手套和一次性口罩，并经常更换手套；

2.特异性RNase抑制剂的应用

（1）氧钒酰核苷复合物（Vanadyl-ribonuCleosideComplexes，VRC）

它是一种由氧化钒离子和四种核苷（腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷）组成的复合物，可与RNase结合而抑制RNase的活性。

常用浓度为10mmol；

（2）RNasin：

为RNase的非竞争、特异抑制剂，1mmol/L二巯基乙醇益于其发挥最大抑制活性。

反复冻融易破坏其活性。

样品中的VRC和RNasin都可用酚抽提方法去除。

3.组织块用液氮研磨，效果最好；

若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替， 

此时组织块需先用眼科剪将组织绞碎，然后再充分研磨。

高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨 

后须4℃ 

12000离心10min去掉不溶物，再进行后面操作。

实验二RNA的甲醛变性电泳

通过实验掌握甲醛变性电泳的原理和方法。

核酸是两性解离物质，一般在pH8.0时向正极移动。

不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由电泳时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开，因此，用适当浓度的凝胶（主要是琼脂糖凝胶和聚丙酰胺凝胶）介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的。

影响核酸分子迁移率的因素主要有核酸分子量大小、电荷密度、颗粒形状、空间构型、胶浓度、电场强度以及缓冲液离子强度等。

一般核酸分子量和形状愈小、电荷密度愈大、胶浓度愈低、电场强度和缓冲液离子强度愈强，则迁移率液愈大。

甲醛作为变性剂，与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定sehiff碱基对，在凝胶中可阻止链内碱基配对，使RNA维持在变性状态，sehiff碱基对不稳定易被稀释除去。

核酸凝胶电泳结果的检测方法有EB（溴化乙锭）、银染法及同位素放射自显影等，其中最常用是EB染色法。

EB是一种荧光染料，可嵌入核酸的配对碱基中，在紫外下发出荧光。

RNA分子中常用存在自身碱基配对的双链区，也可嵌入EB分子。

1.琼脂糖凝胶电泳系统：

电泳仪、电泳槽

2.紫外观察箱或凝胶成像系统

3.微波炉

1.eppendorf管

2.吸头：

200μl、1000μl

3.枪头盒、eppendorf管盒

4.移液枪：

5.胶带纸、培养皿

1.琼脂糖

2.DEPC水

3.10×

电泳缓冲液

吗啉代丙磺酸（MOPS）0.2mol/L

NaAc20mmol/L

乙二胺四乙酸（EDTA）10mmol/L

将4.18g3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）溶于70mlDEPC水中,调pH值至7.0,加2mlDEPC处理的1moL/L乙酸钠和2ml经DEPC水配制的0.5mol/LEDTA.Na2，（pH8.0）再用DEPC处理水定容至100mL。

避光室温保存。

4.上样缓冲液

甘油50％

EDTA1mmol/L（pH8.0）

溴酚兰0.25％

二甲苯青FF0.25％

5.37％甲醛

6.溴化乙锭（EB）：

200μg/ml

7.甲酰胺

1.电泳槽的处理

用去污剂洗涤电泳槽，再用水冲净，用无水乙醇漂洗、干燥，然后在3％H2O2中浸泡30min,弃3％H2O2，用0.1%DEPC处理水将其彻底冲洗干净；

2.胶版制作

取一干净的胶板，用胶带纸将胶板两端封住，放于平台上，插入梳子；

3.凝胶制备（以1.5％胶，配制30ml为例）

称0.45g琼脂糖熔于21.6mlDEPC处理水中，冷至60℃，加入20μlEB、3ml10×

甲醛凝胶电泳缓冲液（终浓度为1×

）和5.4ml37％甲醛（终浓度为2.2mol/L），混匀，再倒入制备好的胶板内，化学通风橱凝胶,室温放置，凝固后取出梳子，在胶板上留下的孔为加样孔，并取下胶带纸，放入电泳槽中，加入1×

甲醛凝胶电泳缓冲液至没过胶面;

4.样品制备

在0.5mleppendorf管中加5μlRNA提取液，然后依次加入2μl10×

mops，10μl甲酰胺，3μl甲醛溶液，65℃水浴变性15min，冰中冷却，稍离心，加2μl上样缓冲液，混匀；

5.将上述样品20μl加入加样孔中，电压80V，电泳约1hr。

至溴酚兰移出8cm。

可用已知大小的RNA作为分子量标准参照物。

（RNA含量约5-10μg）

6.电泳结束，将胶置于UVP凝胶成像系统中观察、摄像（或在紫外观察箱中下照像）

1.甲醛有毒，最好在通风橱中操作；

2.琼脂糖要完全熔于水中，凝胶不能有气泡存在；

3.电泳胶中含溴化乙啶，最好经处理后丢弃。

实验三RT－PCR

掌握RT-PCR的原理，学会其操作过程。

逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）的原理是：

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：

分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

一、常用反转录酶：

1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱，最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性，最适作用温度为42℃。

3．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：

商品名为SuperScript和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

二、常用合成cDNA引物：

1．Oligo（dT）：

是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly（A）尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

2．特异性引物：

最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

（一）仪器

1.PCR热循环仪、离心机、微波炉

2.琼脂糖凝胶电泳系统：

（一）材料

1.PCR管、吸头：

200μL、枪头盒、PCR管盒

0.5-10μl、5-40μl

（二）试剂

1.RNA提取试剂、第一链cDNA合成试剂盒

2.dNTP、TaqDNA聚合酶

1.合成cDNA

在PCR管中加25μl反应体系：

第一步：

模板RNA（约2μg）2μl

dNTP（10mmol/L）2μl

Oligo（dT）2μl

DEPC水4μl

70℃5min然后至冰浴迅速冷却；

第二步：

5×

逆转录缓冲液5μl

RnaseInhibitor0.2μl

M-MLV逆转录酶（200U）0.5μl

DEPC水9.3μl

37℃水浴1.5h,95℃3min,-20℃保存

2．PCR：

（1）取PCR管配制25μl体系，依次加入下列试剂：

第一链cDNA2μl

上游引物（10pM）1μl

下游引物（10pM）1μl

dNTP（10mmol/L）0.5μl

10×

PCRbuffer2.5μl

Taq酶（4u/μL）0.2μl

MgCl21.5μl

ddH2O16.3μl

轻轻混匀，离心；

（2）PCR扩增反应条件为：

①94℃预变性5min

②94℃变性30s

③56℃退火30s（根据引物的设计来确定最佳温度，本实验目的基因为IGF-1）

④72℃延伸30s

⑤重复步骤

（2）-（4）35次

⑥72℃延伸10min

⑦4℃冷却恒定

（3）电泳鉴定：

琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

1.在做逆转录反应时，为防止Rnase酶对样品和试剂的污染，实验中要戴一次性手套；

2.逆转录反应dNTP、Mg2＋浓度较高，需将上述反应液稀释5倍后才能用做PCR模板；

3.严格按顺序加各种试剂，加量要准确；

4.各种试剂加完后混匀，离心，以便溶液集中于管底；

5.及时加盖，防止污染。

实验四PCR基因扩增

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程，在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1.变性：

加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键受热段裂成为两条单链DNA模板；

2.退火：

使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火；

3.延伸：

溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），以引物3′端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5′→3′方向延伸，合成DNA新链。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可使基因扩增109倍以上，而实际上一般可达106～107倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。

1.PCR热循环仪

2.离心机

3.琼脂糖凝胶电泳系统：

4.微波炉

1.PCR管

200μl

3.枪头盒、PCR管盒

0.5-10μl、5-40μl

1.10×

PCR扩增缓冲液

500mmol/LKCl

100mmol/LTris·

HCl（pH8.0）

15mmol/LMgCl2

0.1％明胶

2.4×

dNTP

2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP

3.Tag酶：

1U/μl

4.DNA模板：

10ng/μl

5.引物1（10μmol/L）：

5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′

6.引物2（10μmol/L）：

5′CTCCTTATTGTCACGCACGATTTC3′

7.无菌双蒸水

1.

在0.5ml管内配制50μl反应体系

反应物体积/μl（浓度）

模板DNA1.0（10ng）

引物11.0（10μmol/L）

引物21.0（10μmol/L）

dNTP1.0（2.5mmol/L）

Tag酶0.5（5U/μl）

10×

PCR缓冲液（Mg++）5

ddH2O40.5

Total50

图1

2.按下述程序进行扩增

（1）94℃预变性5min

（2）94℃变性1min

（3）52℃退火1min（根据引物的设计来确定最佳温度）

（4）72℃延伸1min

（5）重复步骤

（2）-（4）35次

（6）72℃延伸10min

（7）4℃冷却恒定

3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制1％-2%琼脂糖凝胶，取10μl扩增产物电泳，保持电流40mA，电泳结束后紫外观察箱内观察结果。

实验结果见（图1）。

实验五琼脂糖凝胶电泳检测DNA

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。

1.恒温培养箱

3.台式离心机

4.高压灭菌锅

5.微波炉

6.紫外观察箱

5-40μl

1.5×

TBE缓冲液（5倍体积的TBE贮存液）

配1000ml5×

TBE：

pH8.0

Tris54g

硼酸27.5g

EDTA.Na23.7g

2.6×

凝胶加样缓冲液

蔗糖40％

3.琼脂糖

4.溴化乙锭溶液（EB）：

200μg/ml，由于EB易见光分解，用铝铂纸或黑纸包裹容器，放于室温下，EB为致癌强烈诱变剂，操作要小心。

（一）制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度/％线性DNA的有效分离范围/kb

0.35-60

0.61-20

0.70.8-10

0.90.5-7

1.20.4-6

1.50.2-4

2.00.1-3

称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×

TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。

（二）胶板的制备

1.取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（不能留缝隙）；

2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子；

3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入20μlEB，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）；

4.待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将有机玻璃内槽放在电泳槽内；

5.加入0.5×

TBE电泳缓冲液至电泳槽中，刚好没过胶面。

（三）加样

用移液枪将已加入上样缓冲液（约1/5体积，取20μl样品加4μl上样缓冲液）的DNA样品加入样孔（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1.接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm；

2.当溴酚兰染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳（约1-2hr）。

（五）观察

将电泳后的凝胶移入紫外观察箱内观察、拍照。

【实验结果】

在紫外灯（360nm、312nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶，DNA存在处应显现出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护镜，紫外线对眼睛有伤害作用）。