科技成果鉴定材料修.docx
《科技成果鉴定材料修.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《科技成果鉴定材料修.docx（29页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
科技成果鉴定材料修
自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血的
基础与临床研究
鉴定资料
任务来源：
安徽省卫生厅临床医学重点学科应用技术项目
完成单位：
安徽省立医院
二0一0年二月
目录
一工作报告2
㈠课题基本情况2
㈡立项背景2
㈢执行情况及研究成果3
㈣课题经费使用情况4
㈤存在问题4
㈥课题组主要成员5
二研究（技术）报告7
㈠国内外研究动态7
㈡研究经过10
第一部分自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究11
第二部分自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血的基础研究18
㈢结论性意见28
三发表及待发表论文29
四查新报告30
五推广应用31
六课题组成员32
一工作报告
㈠课题基本情况
⒈课题名称：
自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血的基础与临床研究
⒉课题来源：
安徽省卫生厅临床医学重点学科应用技术项目（编号：
05A027，2008A056），是我科下肢动脉缺血系列研究的重要组成部分。
⒊课题起止时间：
2004年01月——2010年12月
⒋课题承担单位：
安徽省立医院
㈡立项背景
近年来，随着社会的发展，生活水平的不断提高，饮食结构改变，人口老龄化的发展，以及血管外科诊疗水平的不断发展，动脉粥样硬化及糖尿病微血管病变所致的缺血性疾病发病率有明显的增加趋势。
尤其下肢缺血性疾病是临床上常见的致残性疾病。
关于肢体缺血的治疗，目前临床通常的治疗方法主要包括药物治疗和手术治疗，并可辅以高压氧治疗、中药治疗。
药物治疗主要用于病变早期、轻度的患者及无法行下肢血管重建的患者，大多数效果不理想。
外科手术治疗以及近年来发展的血管腔内治疗技术主要用于大中动脉病变，术后早期易并发血栓形成，晚期可再度发生狭窄。
对于下肢动脉远端流出道闭塞而且缺乏代偿性侧支的患者，采用上述方法往往很难使血管再通，而且这类患者多为年老体弱的高龄患者，常常伴有心脑血管病变，体质差无法耐手术治疗，最终难以避免高平面的截肢，给患者造成极大的身心痛苦。
因此对于远端流出道差的下肢缺血性血管疾病，如何重建侧支循环、提高患者生活质量、降低截肢率，是目前血管外科临床面临的重要课题。
随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展以及对干细胞研究的深入，采用治疗性血管新生方法在缺血部位重新建立有效的侧支循环逐渐成为可能。
动物实验证实，将骨髓单个核细胞植入梗死肢体后可促进局部的血管形成，并肯定移植的内皮细胞祖细胞（EPCs）参与了新的毛细血管的生成。
根据这些结果，国内外逐渐开展了应用骨髓造血干细胞移植治疗周围血管病患者的研究。
尽管自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血取得了一定的经验，但通常骨髓采集量较大（300～500mL），对患者的身体条件要求高，并且有些患者由于惧怕骨髓穿刺而拒绝接受。
有实验研究表明，动物和人的外周血中可分离到EPCs，重组粒细胞集落刺激因子（G-CSF）能够有效的将骨髓中EPCs动员到外周血循环。
因此我们自2004年1月以来开展了自外周血提取干细胞治疗下肢缺血性疾病的临床研究，并针对临床研究中遇到的外周血干细胞数量少、骨髓动员存在一定风险，以及移植后局部血管新生需要长期维持等问题，开展了促进外周EPCs扩增、分化及归巢方面的基础研究。
㈢执行情况及研究成果
基于干细胞研究技术的进步，在安徽省卫生厅临床医学重点学科应用技术项目资金支持下，我们于2004年在省内率先、国内较早开展了提取自体外周血干细胞移植治疗严重下肢缺血的攻关研究，并把紧密结合临床，系统的开展了有关基础研究工作。
在临床研究实施阶段，我们主要针对外周血干细胞采集时机、移植的规范化操作、干细胞移植的安全性进行了深入的研究。
共有48例患者66条患肢纳入治疗，在以重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员骨髓单个核细胞进入外周血后，当WBC>20×109/L且MMC>30%时开始从外周血采集，并以采集的单个核细胞行缺血患肢局部肌肉注射。
术后大部分患者疼痛程度减轻、溃疡愈合、截肢平面降低，总有效率为74.2%（49/66）。
其中，对血栓闭塞性脉管炎患者的应用效果明显优于下肢动脉硬化闭塞症患者。
通过对部分患者长达5年的随访，未发现因血管增生所致的增殖性视网膜病变、血管内皮恶性肿瘤以及血管瘤等相关并发症，因此对于由于下肢远端动脉流出道差无法进行旁路手术或介入手术治疗的患者，或者由于年老体弱等原因不能耐受手术的患者，自体外周血干细胞移植提供了安全、有效的治疗手段。
基础研究着重解决的是外周血中EPCs的数量与质量问题。
在体外对如何来提高外周血中EPCs的增殖及分化能力，并促进其血管新生能力进行了深入的研究。
我们首先以血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子成功的将外周血干细胞诱导向内皮细胞分化，并利用药物（巴曲酶）、细胞因子、基因转染等技术手段来增强外周血中EPCs的增殖与分化能力，促进其向缺血部位的归巢，提高其血管新生能力。
通过本项目的基础研究，丰富了外周血干细胞在肢体缺血性疾病的中应用的理论依据，并为解决外周血干细胞数量与质量问题，增强其血管新生能力提供了强有力的实验依据。
基础与临床互相结合，为下一步临床更加有效、快捷、安全的使用外周血干细胞提供了更好的技术与理论支持。
通过近7年的研究，共发表相关论文10余篇，举办学习班3次，并4次在国内外学术会议上交流，受到国内外同行的关注与肯定。
在此期间，共培养硕士研究生4名。
研究成果在已在省内外多所医院获得推广应用，应用病例约30余例，取得了满意疗效，提高了患者的生活质量，收到了明显的社会效益和经济效益。
㈣课题经费使用情况
科目
金额（万元）
备注
1.人员费
0.4
研究生补贴、科研劳务费
2.试验材料费
2.9
试验所用材料及检测费用
3.会议费
0.4
参加会议及学习交流的交通费用
4.其他相关费用
0..3
文献检索、论文发表
总计
4.0
㈤存在问题
尽管临床研究中我们发现自体外周血干细胞移植可以显著提高严重下肢缺血的治疗效果，但对于其具体的作用机制还不甚清楚，如：
究竟外周血细胞中哪些细胞成分对血管新生有更多的益处，哪些混杂细胞可能无效甚至有抑制作用，干细胞的纯化是否更有效？
因此我们在下一步的研究过程中将关注怎样对这些细胞成分和数量进行有效搭配，达到进一步提高干细胞治疗疗效的目的。
㈥课题组主要成员
序号
姓名
性别
出生年月
技术职称
文化程度
工作单位
对成果创造性贡献
1
胡何节
男
1963.02
主任医师
硕士
安徽省立医院血管外科
全面负责课题设计和实施
2
王晓天
男
1967.11
副主任医师
学士
安徽省立医院血管外科
具体负责课题临床研究的实施及资料的采集
3
邓福生
男
1963.06
主任医师
学士
安徽省立医院血管外科
参与课题临床及基础研究的实施
4
方征东
男
1974.08
主治医师
博士
安徽省立医院血管外科
参与课题基础研究的实施及资料采集
5
孙小杰
男
1981.10
住院医师
硕士
安徽省立医院血管外科
参与课题基础研究的实施及资料采集
6
7
8
9
10
11
12
附：
发表论文题录
1.李环宇,胡何节,邓福生,王晓天,孙小杰.自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血27例.中国组织工程研究与临床康,2010;14（40）7572-7575
2.胡何节,卞剑,邓福生,王晓天.巴曲酶对下肢深静脉血栓患者内皮祖细胞的影响,中华生物医学工程杂志,2010;16
（2）87-92
3.赵亲明,胡何节,邓福生,王晓天,孙小杰.人VEGF165基因转染人外周血内皮祖细胞的实验研究,中国普通外科杂志,2009;18（12）1263-1266
4.卞剑,胡何节.内皮祖细胞的生物学特性与下肢缺血性疾病.中华老年多器官疾病杂志,2009;8
（1）88-91
5.孙小杰,胡何节,邓福生,王晓天.巴曲酶对体外培养下内皮祖细胞数量及功能的影响,中华老年心脑血管病杂志,2008;10（3）206-209
6.孙小杰,胡何节,血管内皮祖细胞与调控性细胞因子.国际外科学杂志,2007;34（12）831-834
7.吴维,胡何节,邓福生,王晓天,雷春,欧阳波.血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子体外联合诱导外周血单个核细胞定向分化为血管内皮细胞.中国组织工程研究与临床康,2007;11（11）2094-2097
8.吴维,余继海,胡何节.脂肪组织来源的基质细胞与血管新生.蚌埠医学院学报,2007;32（3）369-370
9.吴维,胡何节,余继海.体外诱导成人外周血干细胞向血管内皮细胞分化.安徽医科大学学报,2007;42
（2）151-153
10.葛新宝,胡何节,邓福生,王晓天,孙小杰.基质细胞衍生因子联合外周血内皮祖细胞移植治疗裸鼠肢体缺血的实验研究，中华普通外科杂志（已接受）
二研究（技术）报告
㈠国内外研究动态
随着饮食结构的改变、人口老龄化的加剧，包括动脉粥样硬化、糖尿病等引起的下肢缺血性疾病的发病率在逐年增高。
下肢缺血性疾病的治疗也正经历从传统经典的旁路手术到现代腔内微创治疗的发展，但无论采用何种治疗方法都需要有良好的流出道，对于因无流出道的严重下肢缺血一直缺乏有效的治疗方法。
近年来，随着分子生物学技和细胞生物工程技术的发展以及对干细胞研究的深入，使采用细胞治疗等治疗性血管生成方法在缺血部位重新建立有效的侧支循环逐渐成为可能，从而为下肢缺血性疾病的治疗提供了新的策略。
干细胞移植治疗缺血疾病主要是利用干细胞具有高度自我更新、增殖和能分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞的潜能。
与以往主要是血管再通的治疗理念不同，干细胞移植术的主要是通过血管新生达到血液循环重建、血供改善的目的。
自从Asahara等1发现在体循环外周血中存在内皮祖细胞（EPCs）以来，以补充EPCs促进新生血管生成来治疗缺血性疾病的新疗法逐渐成为研究的热点。
EPCs是一类具有持续增殖和多向分化能力的内皮细胞前体细胞。
EPCs促进新生血管形成的机制是通过EPCs自身的增殖、分化而形成新生血管，无需依赖原有的血管系统，它与血管生成有本质区别。
EPCs不仅在胚胎时期参与血管发生，在出生后的缺血下肢、缺血心肌、受伤角膜、损伤皮肤以及肿瘤血管形成处，EPCs也帮助血管新生。
Murasawa等2发现，在动物模型中EPCs可定向结合到体内活跃的血管再生部位，参与血管新生，无论是骨髓还是外周血的EPCs均能增加毛细血管密度及局部缺血部位的血管再生作用。
EPCs大量存在于正常骨髓、脐血、外周血和脾中，其中主要存在于骨髓中，因此骨髓干细胞移植是开展较早、较为广泛的一种方法。
在大量动物实验和基础研究的证实下，2002年日本Kansai医科大学3首次报道了应用骨髓单个核细胞移植治疗人的下肢缺血性疾病的临床研究。
后来，Miyamoto等4和Hasebe等5也分别报道了骨髓单个核细胞自体回输改善肢体缺血的数例病例，证实该方法在肢体缺血治疗中安全、有效。
我国谷涌泉等6、7也于2003年开始应用相似的方法对下肢严重缺血性疾病进行临床研究，结果显示出积极的效果。
随后，此项技术逐步开展起来，为部分不能进行手术或者介入治疗的患者带来了福音。
自体骨髓单个核细胞移植移植虽然简单易行，但通常骨髓采集量大（300～500mL），对患者的身体条件要求高，一般患者难以接受，并且有些患者由于惧怕骨髓穿刺而拒绝接受，使得自体骨髓单个核细胞移植在临床应用受到一定限制。
既然骨髓单个核细胞移植操作风险相对较大，而外周血中也存在EPCs，能否直接从外周血中提取EPCs呢？
正常条件下，外周血造血干细胞的数量很低，约占单个核细胞的0.01%～0.1%，难以满足外周血干细胞移植的需求。
近年来，随着干细胞动员药物及血液细胞分离机的广泛应用，使动员骨髓中的干细胞进入外周血循环并进行分离纯化成为可能。
常用的动员药物有：
粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。
我们在国内较早的开展了这方面的临床研究工作，并取得了较为满意的效果8。
结果显示大部分患者的溃疡、静息痛等症状得到明显缓解，而且多普勒超声检查也显示患肢血流增加，踝肱指数改善，未发现明显不良反应。
外周血单个核细胞移植同骨髓单个核细胞移植相比，具有采集方便、不需要麻醉等优点，无多部位骨髓穿刺抽髓的痛苦和不便，患者易于接受，尤其适合高龄、合并症多或不愿抽髓的患者。
目前，这种方法已经越来越多的被应用到临床。
由于外周血中用来移植的EPCs数量有限，用G-CSF动员也存在出现白细胞增多或血液高凝状态而诱发心绞痛或急性动脉血栓形成的可能。
如何利用有限的EPCs更好的促进下肢血管新生是目前研究的热点。
运用各种生长因子进行体外扩增在一定程度解决了移植EPCs的数量问题，但是EPCs的功能及老化问题不能得以解决。
基因转染使细胞功能得到改善，显著减少移植细胞数量并避免了促血管因子的全身不良反应，并能阶段性地持续释放促血管因子。
VEGF是目前已发现的众多血管生成正性调节因子中促血管生成效应最强的内皮细胞特异的生长因子。
Iwaguro等9将编码VEGF的基因导入EPCs，再应用于动物模型当中，结果发现转基因的EPCs展示出更强大的增殖、黏附及整合能力，并且还能作为分泌细胞促进其他已分化成熟的内皮细胞增殖、迁移。
这些经过基因修饰的EPCs具有诱发和促血管新生的双重功能，其血管新生效率比内皮细胞高出30倍。
我们的研究结果同样证实了上述观点10。
同时，我们11、12还发现抗纤溶药物巴曲酶及骨髓基质细胞衍生因子-1均有利于EPCs增殖、分化及归巢。
与自体干细胞相比，脐带血因其来源丰富且制备便利，已成为可供临床移植用造血干/祖细胞的重要替代来源，正日益受到国内外学者的高度重视。
有研究表明13，脐带血和骨髓中所含CD34+细胞的数量没什么差别，而且脐血CD34+细胞的增殖分化能力高于骨髓，尤其加入各种细胞因子后，混合集落形成单位、红系造血祖细胞集落数都明显高于骨髓，也高于成人外周血；将这些细胞分离移植到裸鼠的缺血部位，可以发现侧支血管的新生及血流的改善。
最近，我国于崇岗等14报道了11例利用脐血干细胞移植治疗糖尿病足的临床研究结果，取得了与自体干细胞相似的治疗效果。
但由于目前使用的脐带血基本都是异体的，移植到患者体内会导致免疫性移植物抗宿主反应，抗排斥反应仍是我们需要面对的难题。
外周血干细胞移植方法给肢体缺血性疾病的治疗带来了很大的希望，但由于这些技术开展的时间不长，基础和临床研究仍存在很多问题，如：
移植细胞的数量与疗效的关系、细胞移植的最佳途径、细胞移植的长期安全性、移植后功能改善的机制等。
虽然有许多问题尚需解决，但该手段较传统的治疗方法已展示出无可比拟的优越性。
相信随着基础与临床研究的不断深入，采用外周血干细胞治疗缺血性疾病有着更加广阔的发展空间。
参考文献
1.AsaharaT,MuroharaT,SullivanA,SilverM,vanderZeeR,LiT,etal.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis.Science.1997Feb14;275（5302）:
964-7.
2.MurasawaS,AsaharaT.Endothelialprogenitorcellsforvasculogenesis.Physiology（Bethesda）.2005Feb;20:
36-42.
3.Tateishi-YuyamaE,MatsubaraH,MuroharaT,IkedaU,ShintaniS,MasakiH,etal.Therapeuticangiogenesisforpatientswithlimbischaemiabyautologoustransplantationofbone-marrowcells:
apilotstudyandarandomisedcontrolledtrial.Lancet.2002Aug10;360（9331）:
427-35.
4.MiyamotoM,YasutakeM,TakanoH,TakagiH,TakagiG,MizunoH,etal.Therapeuticangiogenesisbyautologousbonemarrowcellimplantationforrefractorychronicperipheralarterialdiseaseusingassessmentofneovascularizationby99mTc-tetrofosmin（TF）perfusionscintigraphy.CellTransplant.2004;13（4）:
429-37.
5.HasebeH,OsadaM,KodamaY,FujiokaD,SanoK,NakamuraT,etal.[Therapeuticangiogenesisbyautologoustransplantationofbone-marrowcellsinapatientwithprogressivelimbischemiaduetoarteriosclerosisobliterans:
acasereport].JCardiol.2004Apr;43（4）:
179-83.
6.谷涌泉,张建,郭连瑞,汪忠镐,张淑文,等.自体骨髓干细胞移植治疗下肢严重缺血32例报告.中国临床康复,2004,8（35）:
7970-7972.
7.GuY,ZhangJ,QiL.Aclinicalstudyonimplantationofautologousbonemarrowmononuclearcellsafterbonemarrowstimulationfortreatmentoflowerlimbischemia.ZhongguoXiuFuChongJianWaiKeZaZhi.2006Oct;20（10）:
1017-20.
8.李环宇,胡何节,邓福生,王晓天,孙小杰.自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血27例.中国组织工程研究与临床康,2010;14（40）7572-7575.
9.IwaguroH,YamaguchiJ,KalkaC,MurasawaS,MasudaH,HayashiS,etal.Endothelialprogenitorcellvascularendothelialgrowthfactorgenetransferforvascularregeneration.Circulation.2002Feb12;105（6）:
732-8.
10.赵亲明,胡何节,邓福生,王晓天,孙小杰.人VEGF165基因转染人外周血内皮祖细胞的实验研究,中国普通外科杂志,2009;18（12）1263-1266.
11.胡何节,卞剑,邓福生,王晓天.巴曲酶对下肢深静脉血栓患者内皮祖细胞的影响,中华生物医学工程杂志,2010;16
（2）87-92.
12.孙小杰,胡何节,邓福生,王晓天.巴曲酶对体外培养下内皮祖细胞数量及功能的影响,中华老年心脑血管病杂志,2008;10（3）206-209.
13.WattSM,ContrerasM.Stemcellmedicine:
umbilicalcordbloodanditsstemcellpotential.SeminFetalNeonatalMed.2005Jun;10（3）:
209-20.
14.于崇岗,崔中平,刘长江.脐血干细胞移植治疗糖尿病足11例．中国组织工程研究与临床康复.2009,13（23）:
4593-4596
㈡研究经过
目前下肢缺血性疾病的治疗正经历从传统经典的旁路手术到现代腔内微创治疗的发展，但无论采用何种治疗方法都需要有良好的流出道，对于因无流出道的严重下肢缺血一直缺乏有效的治疗方法。
尽管动物实验研究已经表明，外周血干细胞注入肢体内有促血管新生作用，但目前临床还缺乏规范的治疗方案，细胞移植的安全性仍存疑问。
本课题组自2004年1月开始设计通过G-CSF动员骨髓中单核细胞进入外周血，提取后移植治疗无流出道的严重下肢缺血。
并针对外周血EPCs数量少，开展了体外扩增EPCs、改善EPCs功能，从而促进EPCs血管新生能力的基础研究。
第一部分自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究
我们于2004年开始在国内较早开展了自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究，共治疗48例患者共66条患肢，症状缓解或减轻49例，有效率达74.2%。
在研究开始阶段，病例拟定的纳入标准为：
Fontaine分期Ⅱ期～Ⅳ期的慢性下肢缺血患者，下肢远端没有动脉流出道，药物保守治疗效果不佳，并且无法进行下肢动脉旁路手术或血管腔内治疗。
排除标准为：
近5年内明确有恶性疾病的患者及血中肿瘤标记物水平明显升高者；严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不能耐受干细胞移植手术者，血糖控制不好的糖尿病患者。
1临床资料
2004年1月到2010年12月，本项目组共收治48例下肢缺血患者，女性5例，男性44例，年龄24~88岁，年龄平均50岁。
48例患者共66条患肢，病因主要包括动脉硬化性闭塞症20例29条患肢，糖尿病2例3条患肢，血栓闭塞性脉管炎26例34条患肢（具体资料见附表：
病人的原始资料）。
临床表现按照缺血严重程度Fontaine分期，Ⅱ期12例17条患肢（25.8%），Ⅲ期30例39条患肢（59.1%）Ⅳ期6例10条患肢（15.1%）。
术前CTA或下肢动脉造影检查，显示股浅动脉及其以远的动脉全部闭塞有7例9条患肢，腘动脉及其以远动脉闭塞有17例26条患肢，小腿动脉（胫前动脉、胫后动脉和腓动脉）全闭部塞有24例31条患肢。
所有病人术前影像学检查均提示下肢动脉远端流出道闭塞，无法行旁路手术或腔内手术治疗。
2方法
2.1移植前准备
⑴所有患者术前除常规检查评估机体全省状况外，均评估有无血液系统疾病、恶性肿瘤。
⑵外周血单个核细胞动员：
重组粒细胞集落刺激因子300ug/天，皮下注射，于第三天开始查常规和单个核细胞计数，当WBC>20×109/L且MMC>30%时开始采集。
2.2细胞采集
使用血细胞分离仪3000Plus采集外周血单个核细胞，（采集后的细胞悬浊液一般为100ml左右,细胞总数5×109个）。
按30ml/每肢体离心浓缩成细胞悬浊液，单个核计数总数达1×1010/ml，于取后3小时内移植致患肢。
（干细胞动员时以低分子肝素抗凝）
2.3移植方法
所有患者均行患肢缺血局部肌肉注射（图1）。
于洁净室内，常规消毒铺巾
升级会员 