原位杂交步骤自己整理的1.docx
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原位杂交步骤自己整理的1
荧光原位杂交
试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：
1×PBS：
NaCl8g∕L、KCl0.2g∕L、Na2HPO41.44g∕L、
KH2PO40.24g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；
PBST：
PBS加0.1%吐温-20；
LiCI：
配4MLiCI100ml需要LiCI．H2025.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：
准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：
本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH（放置一段时间待其pH稳定后），据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：
根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：
将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；
50%甲醇／PBST：
将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；
25%甲醇／PBST：
将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；
HYB－溶液：
50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2
HYB＋溶液：
HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.2
50%甲酰胺／2×SSCT：
50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；
2×SSCT：
2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；
MAB马来酸缓冲液（Maleicacidbuffer）：
100mMmaleicacid，150mMNaCl，pH7.5（20℃），溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH为7.5，并过滤除菌（sterile）
MABT:
MAB，使用前加入0.1%吐温-20；
10×Blockingreagent（阻断剂）：
将阻断试剂（Blockingreagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？
（isautoclaved）并分装后保存于－20℃。
封闭缓冲液（blockingbuffer）：
10%羊血清、2%阻断剂（终浓度），两者溶于MABT；三者MABT:
羊血清：
10%阻断剂=7:
1:
2；也有用：
1×PBT，2%sheepserum（vol/vol），2mg／mlBSA）
1×Blockingreagent：
用马来酸缓冲液将10×Blockingreagent稀释1×Blockingreagent。
此溶液需要随配随用，不可久放。
标准杂交缓冲液（standardhybridization）：
5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine（w/v），0.02％SDS（w/v），1％Blockingreagent（取1/10体积的10×Blockingreagent）
标准杂交缓冲液（含甲酰胺）：
50%去离子甲酰胺，5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine（w/v），0.02％SDS（w/v），2％Blockingreagent（取1/5体积的10×Blockingreagent）
蛋白酶K储液：
10mg／ml；将蛋白酶K按10mg／ml溶于PBT中，分装成100ul的小包装，保存于－20℃。
使用浓度为10ug／ml。
（注：
PBS不需要除酶，因为蛋白酶K可以降解RNase）
抗地高辛荧光素偶联的抗体（Anti-digoxigenin-fluorescein，Fabfragments）保存及使用方法：
1、激发最大波长（Excitationmax）:
494nm；发射最大波长（Emissionmax）：
523nm
抗体冷冻干粉末，用1ml双蒸水进行溶解，其终浓度为200ug／ml，即200ng／ul。
注意事项：
此保存液应该在使用前不久进行稀释，（Note:
Thestocksolutionshouldbedilutedshortlybeforeuse）；
2、以上保存液在2－8℃避光条件下，可以保存2个月。
保存液应避免反复冻融，分装后，保存于－20℃
3、推荐使用含0.5%BSA（w／v）的PBS（pH7.4）对以上抗体保存液进行稀释；
4、此抗体可以用来对地高辛标记的复合物进行检测，注意事项：
在使用抗体之前，10000rpm离心5min，且在液面吸取需要的体积。
探针的制备过程：
1、设计上下游引物，加酶切位点（HindⅢ、EcoRⅠ）和保护性碱基（3个保护性碱基），用来扩增目的基因片段，回收目的基因片段，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切。
2、用限制性内切酶（HindⅢ、EcoRⅠ）对载体pSPT18（约1ug的量）进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的片段，溶于适量无菌水中。
3、将pSPT18酶切回收后的片段与相应酶切的基因片段，按摩尔比例1:
10左右进行混合，加入连接酶，16℃，连接过夜。
4、将以上的重组载体进行转化，选择具有氨苄青霉素抗性的培养基，37℃，培养13-15h，保存于4℃冰箱，再进行挑菌，接种于含1‰氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min条件下，摇菌过夜。
5、次日，用特异性引物做菌落PCR，确定插入目的基因片段重组成功的克隆，保存菌种，其余进行测序验证。
6、选择测序验证成功的相应菌液，进行扩大培养，回收重组质粒。
7、对重组质粒分别进行单酶切（HindⅢ、EcoRⅠ），使其线性化，并回收线性化的质粒DNA，以用于体外转录。
（如何回收较好？
1、PurificationoflinearDNAcanbeachievedbyphenol/chloroformextractionfollowedbyethanolprecipitation.2、）
8、选择插入片段5＇端酶切位点的酶（合成反义RNA）或3＇端酶切点的酶（合成正义RNA）。
对于本实验来说，用RNA聚合酶T7，对HindⅢ酶切的模板DNA进行体外转录，以产生可以检测CXCR7基因mRNA的反义RNA探针；用RNA聚合酶SP6，对EcoRⅠ酶切的模板DNA进行体外转录，产生用于阴性对照的正义RNA探针。
反应体系为20ul,所加模板DNA为1ug左右，10×NTPlabelingmixture2ul、10×Transcriptionbuffer2ul、ProtectorRNaseinhibitor1ul、RNAPolymeraseSP6orRNAPolymeraseT72ul，将以上各个成分轻轻混合后，简单离心，在37℃下孵育2h（延长孵育时间并不能增加标记的RNA的产量；按每1ug模板，可以产生10ug探针RNA）。
9、向上述反应体系中，加入RNase-free的2ulDNaseⅠ，37℃保温15min,以消除模板DNA。
10、向上述反应液中，加入2ul0.2M的EDTA（pH8.0）以终止反应，RNA转录子可以通过琼脂糖凝胶电泳EB染色来进行分析。
11、标记好的探针，不能用苯酚\氯仿进行抽提，这样会导致探针分解。
标记好的探针可以在－15-－25℃，稳定保存至少一年；要避免反复冻融标记好的探针，可以对其进行小管分装，方便使用。
12、需要的试剂：
RNADilutionBuffer:
DMPC处理的RNase-free的双蒸水:
20×SSC:
formaldehyde=5：
3:
2（需要配置新鲜的）；
大飞传给我的：
4）反应结束后加入30µLRNasefree水和30µLLiCl，离心混匀，-20℃1hr
5）14000rpm，4℃离心5min，加入1mL70%乙醇；
6）14000rpm，4℃离心15min，尽量弃上清；
7）室温晾置5-6min：
8）加入30µLDEPCH20，RNAsein1µL，-80℃保存。
12、吸取少量标记好的探针，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测其质量。
好的探针应该会出现一个或两个分离的条带，而不是拖尾，如是拖尾意味着探针有所降解了。
探针标记：
1、用地高辛标记的UTP在体外进行转录（载体pPST18），以获得正义和反义RNA探针，将其溶入无RNase的去离子水中。
探针转录体系如下：
整体原位杂交步骤：
胚胎的准备、固定与保存
1、收集西伯利亚鲟的一定数量未受精卵和受精后各个发育时期的胚胎，用蛋白酶（浓度：
）或手动医用镊子以去除其卵壳。
2、将未受精卵和各期胚胎加入10倍体积的4%多聚甲醛中，4℃过夜。
3、在PBS缓冲液中漂洗胚胎若干次，然后分别依次以不同比例（25%:
75%、50%：
50%、75%：
25%）的甲醇∕PBST，对胚胎进行梯度脱水，每次5min;再用100%甲醇洗一次，时间为5min，最后转至100%甲醇中，-20℃保存备用。
整体原位杂交步骤：
原位杂交第一天：
1、胚胎的复水
在室温下进行以下实验操作，分别依次以75%MeOH/25%PBST、50%MeOH/50%PBST、25%MeOH/75%PBST洗胚胎，以上三操作每次清洗时间为5min；最后用100%PBST漂洗4次，每次5min。
2、用蛋白酶K消化处理及再固定
室温下，以一定浓度（浓度:
10µg/ml）蛋白酶K（用PBST稀释），处理各时期胚胎：
最佳处理时间需根据胚胎发育时期而定（也有言24h以前的不用处理；而其他时期可以聊做参考其他鱼类的：
如周励的鲫鱼小于5体节期可以不用处理、10体节期处理5min；24体节处理10min；对于斑马鱼：
小于5体节期不用处理，10体节期处理1min、24h处理5min、48h处理15min；）。
用PBST清洗胚胎5min，以洗去蛋白酶K，最后再用PBST洗胚胎5min，以洗去残留的蛋白酶K。
然后在室温条件下，用4%多聚甲醛重新固定胚胎，时间为20min（？
对于鲟鱼是否也要适当的延长固定的时间）；再用1×PBST清洗胚胎4（或者3或2次）次，每次5min，以除去残留的多聚甲醛，最后一次清洗将胚胎转移至新的1.5ml的eppendorf管中。
（如果以斑马鱼的胚胎大小为准，可以放置多达50颗胚胎。
）
注：
关于蛋白酶K的消化，时间太短会使探针不能进入，时间太长将会改变胚胎的形态结构。
ProteinaseKPrepare10mg/ml
stocksolutioninPBTandstoreat-20℃in100ulaliquots.Final
concentrationforembryopermeabilizationis10ug/ml；斑马鱼的胚胎各期消化时间可以参与在第七页[1]，
3、准备预杂交和杂交混合液
4、Hybridizationmix（HM）：
50%deionizedformamide，5×SSC，0.1%Tween20，50ug/mlofheparin，500ug/mlofRNase-freetRNAadjustedtopH6.0（6.3大飞）byaddingcitricacid（460ulof1Mcitricacidsolutionfor50mlofHM）。
预杂交液HYB－：
50%甲酰胺、5xSSC（用20xSSC母液稀释）、RNase-free水，0.1%吐温-20。
用柠檬酸（citricacid）调节pH至6.0。
5、
杂交液HYB+：
甲酰胺（Formamide）50%；5xSSC；肝素（Heparin），50µg/ml；
吐温-20（Tween-20），0.1%；tRNA，500µg/ml；
用柠檬酸（citricacid）调节pH至6.0。
6、预杂交
除去PBST，每管取约5-10枚胚胎，向1.5ml的eppendorf管中加入700ul（适量体积）HYB－进行预杂交，在杂交炉中60-68℃保温5min；然后，换用适量体积的HYB＋溶液，68℃预杂交4-6h（70℃，2-5h、其他如roche采取55-65℃或）在70℃条件下，水浴2-5小时。
？
？
？
作用？
（注：
这些预杂交后的胚胎可以在HM中，-20℃条件下保存数周）
7、杂交：
实验设计反义RNA、正义RNA、空白对照组。
用HYB＋溶液将地高辛标记的探针稀释到1ng／ul,72℃加热变性5min，马上置于冰上冷却，以消除探针的二级结构；弃去预杂交液HYB＋，加入新的700ul（其他体积也可以）的HYB＋溶液和适量的探针，使探针的浓度为1ng／ul，65-68-70℃孵育过夜（12-16h）。
（加入包含终浓度为0.5-1.0ng∕µl（30-50ng这个是参考文献[1]）的地高辛标记的反义RNA探针的HM溶液200µl，70℃条件下杂交（有的文献72或80℃加热5min变性，冰上冷却，以此消除探针的二级结构）（杂交炉中？
），过夜（也有65℃,5h；60℃杂交炉中，16h）。
注：
1
、不要使用过量的RNA探针，这会增加背景labeling；2、如此高的杂交温度和HM缓冲液中甲酰胺的比例，保证了探针杂交的严谨度（stringency）和减少了交叉杂交（cross-hybridization）的发生。
杂交温度不要超过72℃，否则探针被破坏。
空白对照组不加入探针。
孵育时，加入的HYB＋应首先预热到70℃，在之后再加入适量探针。
原位杂交第二天：
1、将含有探针的HYB＋溶液吸出，-20℃保存，并可多次重复使用中，一般可使用十次左右，而能够重复使用的次数取决于探针的质量，使用次数越多，得到的信号可能越弱；以下步骤在65-68℃的杂交炉中进行，且注意溶液要预热。
洗去多余的探针：
依次用50%甲酰胺／2×SSCT，30min／次，2次；2×SSCT，15min／次，1次；0.2×SSCT，30min／次，2次（其实可以如下增加75%、25%）。
（或另一方法：
将胚胎的溶液介质环境由HM逐渐过渡到2×SSC，以除去残留在介质中的探针：
由HM经过75%HM、50%HM、25%HM、100%2×SSC，以上每一个步骤都要在70℃水浴中进行并轻轻摇动，每次10min，而不同稀释度的HM用2×SSC稀释，且以上用来洗脱残留探针的HM不包含tRNA和肝素钠（heparin）。
；在70℃条件下，用0.2×SSC漂洗胚胎两次，每次30min，如此高严谨性的漂洗以防止探针非特异性杂交；）
2、以下步骤在室温下进行，通过用一系列1×PBT稀释的0.2×SSC漂洗胚胎，逐渐用PBT取代0.2×SSC，方法如下：
在室温条件下，用一定体积？
的75%0.2×SSC、50%0.2×SSC、25%0.2×SSC和1×PBT，逐次漂洗胚胎各1次，15min／次，并置于水平摇床上（horizontalshaker）以40r.p.m轻摇。
封闭：
1、做此步骤的前提是不用做前面杂交的步骤2，即是用马来酸缓冲液MABT清洗胚胎3次，5min／次，
3、室温下，用适量封闭缓冲液（blockingbuffer：
10%羊血清、2%阻断液，两者溶于MABT；三者MABT:
羊血清：
阻断剂=7:
1:
2；也有用：
1×PBT，2%sheepserum（vol/vol），2mg／mlBSA）温育（incubate）胚胎1-3h，并置于摇床上轻微摇晃，此步骤在于使抗体的非特异性结合位点饱和（saturates）。
4、（也即是：
更换新鲜的封闭缓冲液，加入比例1:
5000的抗地高辛荧光素标记的抗体，）将胚胎置于含1/10000（多数文献是1:
5000）抗地高辛荧光素标记的抗体的封闭缓冲液中，4℃过夜，且置于以40r.p.m.的水平摇床（振荡器？
）上（horizontalshaker）轻轻摇晃。
原位杂交第三天：
1、弃去抗体溶液，并用PBT简要地（briefly）漂洗胚胎；然后室温下，再用PBT漂洗胚胎6次，每次15min，每次漂洗的同时将其置于horizontalorbitalshaker以40r.p.m.轻轻摇晃。
（其他漂洗方法：
？
），干燥？
（其他漂洗方法重点参考：
室温下洗去多余的抗体：
hybridizationsolutioncontains50%formamide（UltraPurefromUSB,USA）in2×SSC，罗氏202页资料：
分别用不同混合比例的杂交缓冲液（hybridizationsolution）／1×PBS（3:
1、1:
1、1:
3）清洗胚胎，每次20min，各1次，最后用1×PBS清洗胚胎4次，15min／次）
2、室温下，用alkalineTrisbuffer（配方见文献1，这个对于AP及其底物显色才合适）在horizontalorbitalshaker上以40r.p.m.轻轻摇晃，进行漂洗3次，每次5min。
3、这个步骤对于AP除去alkalineTrisbuffer，用新鲜配制的0.7ml染色液将其替代，并置于黑暗环境中（这个步骤是按照AP-BCIP\NBT来进行的）。
检测观察拍照并记录：
1、是否还需要4%多聚甲醛固定？
，原位杂交胚胎经梯度甘油／PBST透明后（30%甘油／PBST、50%甘油／PBST、70%甘油／PBST、100%甘油／PBST），连同少量100%移到载玻片，观察拍照。
拍照后可移回4%PFA？
或甲醇中？
保存
杂交漂洗缓冲液HyB-:
甲酰胺（Formamide）50%；
5xSSC；
吐温-20（Tween-20），0.1%；
用柠檬酸（citricacid）调节pH至6.0。
1、可选择做法：
在加入胚胎之前，预热HyB–；
2、将包含RNA探针的HyB+吸出，保存于-20℃；在没有如何信号损失的情况下，该探针可以重复多次使用。
3、100%HyB–，70℃短暂地漂洗；
4、75%HyB–∕25%2xSSCT，70℃，15min；
5、50%HyB–∕50%2xSSCT，70℃，15min；
6、25%HyB–∕75%2xSSCT，70℃，15min；
7、2xSSCT，70℃，15min；
8、0.2xSSCT，70℃,30min，漂洗2次（如果第一天杂交使用的是50%甲酰胺，以下相同）；或0.05xSSCT，70℃,30min，漂洗2次（如果第一天杂交使用的是65%甲酰胺）（注：
对于）
9、75%0.2（or0.05）xSSC/25%PBT，室温，10min；
10、50%0.2（or0.05）xSSC/50%PBT，室温，10min；
11、25%0.2（or0.05）xSSC/75%PBT，室温，10min；
12、PBT，室温，10min；
13、加入杂交封闭液：
PBT/2%羊血清/2mg/mlBSA（有的文献周励加入roche的阻断剂于MABT中，前面步骤也有此方面的操作，待确定？
？
？
），室温下，孵育若干小时（3小时）？
14、换上新鲜的杂交封闭液，加入荧光素（fluorescein）标记的抗地高辛的抗体反应液（1:
200），4℃摇洗过夜。
.
原位杂交第三天：
漂洗：
室温下，洗去多余的抗体，彻底地漂洗干净。
1、室温下，PBT快洗一次
2、室温下，PBT漂洗6次，每次15min
镜检：
甘油：
PBS=3:
1PBSpH=7.4也可以延长荧光时间，防淬灭（来自周励）
1、将若干盖玻片重叠累加用胶水粘在一起，分别两处固定于载玻片上，其中间留有一定的空隙，将甘油滴到空隙处的载玻片上，放置胚胎，再在其上放置大的盖玻片，可以通过轻轻移动它滚动胚胎的位置，以此在不同的方向上对其进行观察。
所用试剂的配制方法：
3、PBST
以1‰体积的吐温-20溶于PBS中，混匀即可。
4%paraformaldehydeinPBS
10/23/00
1.For100mL.Besttouseglassware,stirbar（搅拌子）setasideformakingparaformaldehydeonly.
2.Put50mLddH2Oinaglassbeaker（烧杯）withastirbarinthebottom.Putstirringonhotplateinthehood.Sethotplatetosetting3-4（about60degrees,makesurethesolutiondoesNOTboil）.
3.Measureout4gofparaformaldehyde（Sigma,storedonthebottomleftinthecoldbox）.MeasureINTHEHOOD（movethescaleinthere）.Addtheparaformaldehydetotheheaterstirringwater.
4.Youneedtoraise（提高）thepHuntilthesolutionclears.Idothisbyaddingafewdrops（2-3）of1NNaOHandwatchthesolution.Gabrielledoeswith10uLof10NNaOHandthatisit.Ifthesolutionfailstoclear,checkthepHbypipettingasmallamountofthesolutionontoapHstrip.Ifyouaretoohigh（>8）ortoolow（<7）keeppHing.YoucannotpHonthepHmeterasitwillberuinedbytheparaformaldehyde.
5.Whendissolved,cool,thenfilter（过滤）thesolutionbypouringthroughapieceoffilterpaperinsideafunnel.Pourintoagraduatedcylindertocheckthevolume.
6.Add10mLof10XPBS.AddddH2Oto100mL.
7.RecheckthepHwithpaper.Adjustcarefullywithsmallamounts
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