离体研究高效转导人的VEGF165基因到骨骼肌肌母细胞.docx

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离体研究高效转导人的VEGF165基因到骨骼肌肌母细胞

离体研究高效转导人的VEGF165基因到骨骼肌肌母细胞

VEGF165为血管内皮生长因子

摘要：

我们报道了将人的VEGF165基因转入人肌母细胞及转导的肌母细胞的特征和转导后的表达效率。

通过免疫染色表达的肌间线蛋白来评估人肌母细胞，构建一个携带人VEGF165的不可复制的腺病毒载体，并被用作人肌母细胞的转导。

将转导的肌母细胞的进行免疫染色来决定转导效率。

通过免疫印迹、酶联免疫吸附、采用人VEGF165的特定引物（…….）进行反转录荧光分析来确定表达效率。

通过人体几代血管内皮细胞的增殖和胸腺嘧啶渗入实验来决定分泌的VEGF165的生物活性，肌母细胞在转导前的纯度为95%，而转导之后的活性却达到99%，western印记和ELISA显示，转导后的肌母细胞高效表达着VEGF165，将肌母细胞与病毒按1:

1000的比例混合8小时，持续3天可实现最大的表达效率。

经过8天的转导处理后培养基中释放的VEGF165达到了峰值。

通过ELISA检测到未经转导的肌母细胞也向体外分泌VEGF165，是由于在转导了VEGF165的肌母细胞的中增加了许多内壁褶皱。

本研究指出人肌母细胞是转导人VEGF165潜在的载体，以实现心脏修复和血管再生。

介绍：

尽管在外科和治疗性血管再生技术取得了一些进展，但是对于治疗缺血性心脏病和血管外周疾病仍然是一个重大挑战。

将基因转导用于治疗性血管生成正被当做一个潜在的策略。

心肌缺血会导致多种血管再生因子和趋化因子的释放，有超过20中因子是关于血管生成，潜在的包括酸性和基本纤维细胞生长因子、血管生成素包括ang-1和ang-2/VEGF亚型、肝细胞生长因子、趋化因子包括1L-1，IL-8和MCP-1，这些都已经被证明可在血管生成中起作用。

记载效果最好的是VEGF亚型，因其能在血管生成中发挥独特的作用。

血管形成是一个连续发生的事件，通过不同的有丝分裂原协调一致进行的。

治疗性血管生成有两种常用的方法：

采用直接注射重组因子的蛋白疗法、依据传递基因编码一个或者更多血管形成因子的的基因疗法，后来的方法是直接给心肌注射裸露的DNA、非病毒载体和病毒载体。

最近的许多方法都是是源自于以上两个基本策略，目的就是为了通过细胞移植来实现血管再生。

通过离体细胞介导的基因转导正被广泛的研究。

最近，已记载的缺血模型中采用工程肌母细胞介导的FGF2传递进行血管再生。

采用肌母细胞将血管形成基因传递到心肌中，类似的报道已有发表。

我们已报道了肌母细胞携带β半乳糖苷酶的报道基因作为一个伴随细胞移植的模型，如同动物模型中的心肌一样。

我们发现移植的肌母细胞存活下来并表达报告基因近30周。

我们正报道的是：

一个高效的腺病毒载体介导的hVEGF165基因导入肌母细胞---它的转导特点和表达效率.我们料定在体外研究中利用肌母细胞作为人类外源性血管形成的载体将会更加安全。

材料和方法

肌母细胞是根据内部操作标准和美国商业机密号5130141的许可而生产的，肌母细胞培养于新加坡细胞移植培养有限公司，依据cGMP和ISO9001，肌母细胞在视野范围内纯度大于98%时收获。

细胞维持在超级培养液中，培养液包含10%FBS，37℃，CO2含量为5%，直到融合且每隔48-72小时持续传代。

HEK-293细胞保存于DEME来自于新加坡国立大学生物科学实验室的geRouwen博士，人脐带静脉内皮细胞有新加坡国立大学动脉粥样硬化研究室的宋杰博士提供，细胞在F-12K培养基中生长。

Hela细胞有新加坡国立大学生理学系hanryyu教授赠送，所有的这些细胞系都保存在基本培养基中，基本培养基补充有1%的青霉素、2%的谷氨酰胺和10%的FBS，这些细胞培养在37℃、CO2含量为5%的环境中。

构建和纯化运载人VEGF165的腺病毒载体

采用HEK-293细胞包裹重组腺病毒，腺病毒穿梭质粒的pCA14携带人VEGF165基因抵达巨噬细胞细胞，过共转染进入EK-293细胞来补救被删除的PJM17Ad5质粒的基因组的E1区域。

该病毒在三次放大前是纯化的斑块，注入补充有DEME的2%FBS的细胞密度为80-90%，在发展为全部细胞病变，收获细胞，反复融冻且通过氯化锶密度梯度离心的标准程序。

通过端点和病毒粒子数来评估病毒滴度，一个光密度计算为1.25*1012个/ml，经证实，未检测到E1DNA的重组病毒无法通过PCR进行复制。

腺病毒运载人的VEGF165到HEK-293细胞中，75mm2的培养物中含有106个细胞，在DEME细胞培养基中补充有10%的FBS。

融合程度达到70%时，用ad-HVEGF和空载腺病毒侵染细胞。

于规定时间内倒掉293细胞的上清液，离心除去细胞碎片，用于肌母细胞的转导。

表达结蛋白的免疫染色

肌母细胞培养在被聚赖氨酸包被的显微镜载玻片上。

采用Sigma公司的免疫染色试剂盒的说明对这些细胞进行结蛋白免疫染色。

在显微视野下根据染色和未染色的细胞数来计算肌母细胞结蛋白的免疫染色的阳性率。

转导HVEGF165到人肌母细胞中

肌母细胞在T225培养瓶的细胞数是107.、，细胞裸露在各种病毒中，，细胞数的比率为2小时、4小时、8小时、24小时。

在预先设定的时间间隔进行侵染，将侵染的培养基换成超级培养基培养24小时，这一转导过程重复三次以便优化转导条件。

Hvegf165转入肌母细胞后的特点

采用hVEGF165ELISA夹心试剂盒检测已转导的肌母细胞所分泌的hVEGF165。

将hVEGF165基因导入肌母细胞后，用六孔培养皿进行组织培养，细胞密度为2×105个/每孔，将经空腺病毒载体转导的肌母细胞与未转导过的肌母细胞做对比，以两天为间隔，每孔收集从第1天到第18天的上清液，并将上清液保存于-20℃直至用于测定，该测定按照供应商的说明进行。

简单的说，将100ul的样品或hVEGF165标品涂布到指定的孔，每个样品一式三份，并将稀释后的25ul生物素化的兔类hVEGF165多克隆抗体分配到每个平皿中，在室温下孵育3小时，用洗涤缓冲液冲洗3次并用碱性磷酸酶于室温下孵育45分钟，使用色剂系统和吸光值为490的酶标仪检测初始抗体。

Western印记分析

肌母细胞在六孔培养皿中进行组织培养，并采用Ad-hVEGF165或孔腺病毒载体进行转导。

转导48小时后收集样品，用PBS洗涤样品3次，0.5mlPBS重悬细胞，并反复融冻5次，细胞提取物以5000rpm进行离心以除去细胞碎片，所得上清液用于免疫染色，将样品等分后煮沸至变性，采用50mM的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，将分离的蛋白质转移至硝酸纤维薄膜上，进行Western印记分析以检测hVEGF165。

用PH7.6含0.05%吐温-2010MmDETris/Hcl将印记冲洗三次，让膜在含有2%的胎牛血清的洗涤液中于室温下孵育一小时，以防止其他非特异性的抗体结合，随后将特异性多克隆抗体hVEGF165按1:

500的比例结合进行孵育。

采用二氨基联苯胺可视化系统显示抗体结合。

内皮细胞增殖测定

人脐静脉内皮细胞培养于F-12K培养基中，该培养基还补充了10%的胎牛血清和20U/ml的肝素。

进行细胞增殖测定时，六孔培养基中，每孔细胞数为1*105个，每个样品重复三次，随后在含有2%的FBS的DEME中培养24小时。

将腺病毒载体VEGF的肌母细胞、未经转导的肌母细胞、空载肌母细胞、与抗h-VEGF165抗体按1:

1000混合的Ad-hVEGF165肌母细胞，将这些不同形式的肌母细胞用PBS清晰两遍，清洗之后与5%CO2，37℃条件下培养72-96小时，最后采用0.1%台酚蓝染色计数并通过胰蛋白酶消化收获。

在补充有10%的胎牛血清和20U/ml的肝素的F-12K培养基中培养人脐静脉内皮细胞，进行胸腺嘧啶[H3]渗入实验，将细胞培养于六孔培养基中，每孔细胞数为1*105个，每个样品重复三次，随后在含有2%的FBS的DEME中培养24小时，腺病毒载体VEGF的肌母细胞、未经转导的肌母细胞、空载肌母细胞、与抗h-VEGF165抗体按1:

1000混合的Ad-hVEGF165肌母细胞，将这些不同类型的肌母细胞用PBS清洗两次后补充2uCi/ml的【H3】胸腺嘧啶.培养72-96小时候，用冰预冷的PBS清洗以除去未渗入的[H3]胸腺嘧啶。

采用0.5ml10.25N的NaOH裂解细胞，5000rpm离心10min以除去细胞碎片。

将上清液（约400微升）与4ml的闪烁缓冲液混合，并采用贝克曼LT-6500闪烁计数器进行计数。

免疫染色

Ad-Hvegf165肌母细胞和空腺病毒载体肌母细胞在涂布有聚赖氨酸的显微载玻片上生长48小时，之后用含有0.05%吐温-20的PBS清洗，并用-20℃预冷的甲醇固定细胞10min，在用1%BSA洗涤液阻断一小时以避免非特异性的抗体反应。

将细胞与原初抗体抗VEGF165按1:

500比例稀释之后于37℃下孵育。

一小时后，用洗涤缓冲液洗涤细胞三次，加入次级抗体HRP于室温下进行酶连结合一小时。

最后将细胞洗涤三次并用DAB显色系统显色。

荧光定量分析经转导的肌母细胞中的hVEGF165基因的反转录。

采用荧光定量分析纯的肌母细胞、空载肌母细胞、Ad-hVEGF165肌母细胞（从第一天到第18天的）。

采用hVEGF165的荧光定量引物（……………….）,GAPDH引物（…………）进行扩增。

其中hVEGF-165引物的Tm至和退火温度分别为68-70℃和64℃，GAPDH的Tm值和退火温度分别为66-70℃和64℃。

采用RNA试剂盒提取总RNA,简单的说，就是在样品中加入300ul的裂解液，裂解3min后收集，随之在细胞裂解液中加入100ul蛋白质-DNA沉淀反应液，进行5min，离心后收集上清液，加入300ul纯的异丙醇混匀，离心后回收RNA，在加入50ul的RNA水合液分离RNA，最后将所得到的的纯的RNA储存于-80℃待用。

结果

肌母细胞的纯度达到98%时进行desmin染色检测。

肌母细胞中的载体粒子数直接影响着转导效率，同样的，肌母细胞在Ad-VEGF165中的裸露时间也直接影响着转导效率，裸露时间更长且病毒滴度更高时，反而对肌母细胞不利，反复的将肌母细胞进行转导以提高转导效率，当肌母细胞与病毒的比例为1:

1000，裸露8小时，3次间隔，在24小时候达到最大转导效率，通过台酚蓝染色检测，细胞存活率在99%以上。

EISA检测结果表明：

转导的肌母细胞持续分泌hVEGF165近30天，0天到24小时分泌量为5±1ng/ml,2天的分泌量为8±2ng/ml，七天的分泌量达到最大为37±3ng/ml.我们的研究还表明：

未经转导的肌母细胞或是空载肌母细胞也分泌有hVEGF165，但是分泌水平非常低（50pg/ml,800±150pg/ml）.这一结果已通过荧光定量和免疫印迹得到了证实，使用抗hVEGF165对细胞培养物的上清液进行免疫印迹分析，显示了培养基个细胞裂解液中含有hVEGF165的存在。

表明hVEGF165肌母细胞向培养基中分泌的hVEGF165是有活性的。

对hVEGF165肌母细胞进行免疫印迹分析，hVEGF165的转导效率高达95%以上。

我们的荧光检测结果和ELISA结果相吻合。

通过VEGF165特异性引物检测到存在mRNA编码hVEGF165，并且表达量很高。

通过人脐静脉内皮细胞的增殖和胸腺嘧啶【H3】渗入测定来检验hVEGF165的生物学活性。

VEGF促进内皮细胞的增殖以及引发DNA的合成。

与实验组相比，未经转导的肌母细胞和空载肌母细胞显示出了较低的增殖率，结果是hVEGF165肌母细胞的特异性多克隆抗血清抑制了人脐静脉内皮细胞增殖的。

这进一步的支持了胸腺嘧啶渗入实验可以确定肌母细胞分泌VEGF165的生物学活性。

讨论

我们的研究计划是将肌母细胞用于转导，采用人自体的肌母细胞来传递hVEGF165基因，已建立肌细胞生成的实验条件。

在心肌疾病方面已报道了成功的移植基因并能高效表达。

在动物模型和人类研究中，VEGF165基因被作为一个裸露的质粒或作为病毒基因盒的载体的一部分被运输到心肌中去。

为了增强血管再生能力而依赖血管再生载体介导的特定导管。

除了这些传统的方法，基因工程细胞植入最近开始盛行，因为它承诺修复心肌梗死。

其中一个比较有趣的方法是在心血管基因治疗领域实现血管生成，促进心肌细胞重建。

这种技术潜在的优点是建立一个心肌储存器作为心肌组织的一部分，这些移植的细胞会提供一个短暂的血管生长因子来源，这有助于维持治疗性的血管生成和组织修复。

对血管生成的研究大多集中在对血管生成因子的使用上，这是在内皮细胞上的一个34-36-kDa的糖蛋白特异性受体。

血管内皮生长因子，VEGF165和VEGF121能有效的刺激血管生成且被广泛的用作研究和临床应用，将肌母细胞用于心肌移植还能促进转基因价值增加，这是一个双管齐下的策略。

肌母细胞一方面能强化梗死的组织，另一方面方面还是能作为治疗性血管生成基因的载体，血管生成因此增强了移植细胞存活的可能性，另一方面也能改良恶性组织缺血环境。

我们目前的研究中，我们已经使用Ad-hVEGF165载体成功的转导了肌母细胞。

转导效率和外源性基因的表达产物的释放量都很高，经免疫印迹测定转导过的肌母细胞所分泌的hVEGF165，被鉴定是分子量为42KDa的蛋白质，人脐静脉内皮细胞增殖测定和胸腺嘧啶【H3】渗入测定结果表明，由肌母细胞分泌的hVEGF165室友生物活性的，它引发了DNA合成和内皮细胞的增殖。

此外，转导的肌母细胞持续分泌hVEGF165长达30天，并在7天时候分泌量达到峰值，这些结果与之前公布的数据并无出入。

在细胞移植后的转入基因的表达时期是一个重要的时期，，根据基因导入肌母细胞的模式，已经报道过的基因表达持续期在5周到3个月到7个月甚至一年。

腺病毒转导的重要特征是高效转导和瞬时表达，我们推测血管生成基因的瞬时表达足以导致血管生成，构建腺病毒载体来传递VEGF165到肌母细胞中，目的是为了让VEGF165瞬时表达来开始血管生成。

我们推测长期的表达是不必要的，因其会产生有害作用。

一旦这过程开始启动，外源基因就无法进一步表达，有可能会产生病变，除了这个，已经报道的直接注射携带外源基因的腺病毒会引起宿主的防御系统的炎症反应和免疫反应，血管形成是基于细胞传递的。

我们的研究结果表明，自体供体细胞持续30天分泌hVEGF165。

持续时间足够长知道血管开始生成，在目前的组织培养研究中，转导Ad-hVEGF165对肌母细胞无不良反应，细胞持续增殖且转导后的细胞活力仍在99%以上，因此有人预计这些细胞在移植后将会在宿主中去分化和形成肌纤维以生成心肌细胞。

总之，我们已经证明了Hvegf165导入肌母细胞后对细胞移植和血管生成都起作用，采用自体细胞进行移植且采用人血管生成因子进行血管生成，将会更加有效且免疫原性更小。