NSFCMSC对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的.docx

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NSFCMSC对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的

项目类别

申报学科代码1

科学部编号

C

C03030310

国家自然科学基金

申请书

项目名称：

MSC对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的实验研究

申请者：

所在单位：

邮政编码：

410xxx

通讯地址：

重庆市xx

电话：

xxx

传真：

xxx

申请日期：

2000年12月

国家自然科学基金委员会

一九九七年制

填报说明

一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。

申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。

表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。

外来语要同时用原文和中文表达。

第一次出现的缩写词，须注出全称。

二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。

第三页起各栏空格不够时，请自行加页。

一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。

地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。

三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。

四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究：

—在读（含在职）研究生

—已离退休的科研人员

—申请单位的兼职科研人员

五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。

六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。

七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。

科学部将对此信息保密。

八、国家自然科学基金委员会通讯地址：

北京市海淀区花园北路35号东门

邮政编码：

xxx

一、简表

－1－

研

究

内

容

和

意

义

摘

要

通

过

M

S

C

体

外

培

养

，

转

化

为

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经

干

细

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因

转

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，

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研

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和

方

法

代

替

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方

法

从

根

本

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改

进

先

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性

巨

结

肠

症

的

治

疗

及

预

后

，

丰

富

临

床

神

经

生

物

学

的

发

展

。

主题词

1.主题词数量不多于三个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）。

中文

M

S

C

神

经

干

细

胞

先

天

性

巨

结

肠

症

英文

mesenchymalstemcell/neuronalstemcell/　aganglionicbowel

简表填写要求

一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。

简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。

高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。

二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。

三、部分栏目填写要求：

项目名称——应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。

基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。

应用基础研究——指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。

申报学科——申请项目所属的最基础学科。

如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。

申请金额——以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。

起止年月——起始时间从申请的次年1月算起。

终止时间为完成年度的12月。

所用实验室——系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。

所在单位名称及代码——按单位公章填写全称。

例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。

全称中的数字，一律写中文，例如：

中国航天工业总公司第七○一所。

首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。

参加单位数——指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位），以阿拉伯数字表示。

项目组主要成员——指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。

本栏双线右侧内容不输入计算机。

研究内容和意义——摘要与主题词均录入软盘。

－2－

二、立论依据

（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）

对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；

对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。

先天性巨结肠症（Hirschsprung’sdisease，HD）是小儿外科领域内的一种常见性疾病，发病率为1/2000~1/5000。

对HD临床及基础研究一直是小儿外科研究的热点之一。

此疾病的发生是由于多种原因使胚胎期神经嵴细胞在消化道移行受阻，结肠壁肌间神经节细胞缺如，病变结肠痉挛收缩，肠内容物排出受阻，近端肠管继发性扩张形成巨结肠，影响儿童健康成长。

自发现HD的病因以来，HD的治疗主要依靠手术切除远端无神经节细胞段，手术方式较多，由于各种术式固有缺陷，目前仍存在各种并发症，影响HD患儿术后恢复［１］。

寻求更为有效及安全的针对HD的治疗方法，一直是国内外小儿外科工作者努力的方向。

在临床及科研工作中我们注意到细胞疗法（celltherapy）近年来已成为治疗多种疾病的新策略，在替代，修复或加强受损的组织或器官的生物学功能方面有巨大作用。

细胞疗法中应用的靶细胞之一，神经干细胞，目前已成为研究热点。

传统的发生生物学认为人体神经细胞一经受损就永远不能再生新的神经元。

然而随着神经干细胞的发现，受损神经细胞不能恢复的观点正在发生变化。

神经干细胞是一种终身具有自我更新能力的细胞，其子细胞能分化产生神经系统的各类细胞，干细胞通过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞具有有限的自我更新能力，并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等，从而生成神经元及神经胶质细胞。

已有研究表明神经干细胞具有潜在多向分化能力，能在一定条件下定向分化，具有较强的增殖能力，移植入成体神经组织后易于存活，目前神经干细胞在损伤神经组织，细胞的修复方面已显示出良好的应用前景[2]。

HD病因为胚胎早期神经嵴细胞移行受阻的结果，以往我们对HD的研究中也发现HD病变肠段不仅存在神经节细胞异常，神经胶质细胞也表现出异常，进一步支持了HD病因系胚胎早期神经嵴细胞移行异常的结果。

对于这种病变肠段无神经节的异常神经支配可否通过神经干细胞进行移植修复呢？

结论是肯定的，Natarajan等在体外实验中观察到正常鼠的神经嵴细胞可在体外修复培养中的RET.K–突变鼠（一种HD动物模型）病变肠段神经支配，且前瞻性地指出了神经嵴细胞移植可能成为今后先天性巨结肠症的治疗手段[3]。

目前的问题是在临床实践中诊断的HD患儿均在出生后，此刻神经嵴细胞分化成熟，

－3-1－

—3-2—

且此类患儿病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等细胞外基质变化，单纯的神经嵴细胞移植一方面神经嵴细胞来源受限，另一方面能否在体内改造病变肠段的病理变化，仍需进一步研究。

近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快，国外有人发现将表达神经营养因子的神经干细胞直接种植于受伤的脑组织中，能促进神经功能的恢复。

神经干细胞在受到碱性成纤维细胞因子（FGF-2）和上皮细胞生长因子（EGF）刺激时可分化出神经元和胶质细胞，EGF可维持神经干细胞的生成，FGF-2对干细胞的分化起重要作用；有很多神经因子（如血小板生长因子，转化生长因子等）对神经干细胞的分化起着协同作用。

诱导分化剂维甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用[3]。

对于HD病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等变化的现象，我们注意到纤溶酶原激活因子（PA）能激活纤溶酶原，水解纤维蛋白，及细胞外基质中的纤连蛋白（fibronectin,Fn），层粘连蛋白（laminin，Ln），基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinaseenzyme,MMP）能分解周围组织—细胞外基质，如将PA，MMP的cDNA转染修饰神经干细胞将有可能对HD病变段的病理变化进行改造，有利于神经干细胞生长，发育。

通过探索影响神经干细胞移植，生长，分化的分子机制，结合基因工程技术，将可为神经干细胞移植治疗成功创造条件。

鉴于神经干细胞的多向分化潜能，在大脑，脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发现，自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提出[4]（此将为神经干细胞自体移植提供一个很好的来源），以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗的载体细胞[5]，针对上面的问题我们提出如下假说：

如同神经干细胞移植在恢复受损大脑，脊髓神经功能上具有良好的应用前景一样，通过各种人工方法修饰后，神经干细胞移植有恢复HD病变肠段的正常神经支配的可能。

细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织是有效的治疗方法，但目前使用的细胞多取自胚胎，这样一方面细胞来源有限，另一方面存在异体免疫排斥作用。

神经干细胞可以在体外大量增殖，但目前主要在海马和室管膜下层发现有神经干细胞分布，这样造成了神经干细胞来源困难。

骨髓中有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）。

前者的移植已成功用于临床治疗白血病，但其移植需要获得足够数量的造血干细胞，并且造血干细胞体外扩增存在困难。

MSC易于从骨髓中分离，体外扩增简单，长期培养过程中能保持多向分化潜能。

近期美国学者Woodbury等在体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨髓MSC转化为神经干细胞,并进而分化为神经元[6]。

此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题，为今后神经干细移植治疗多种神经系统疾病打下了基础。

总之，随着当今干细胞研究的深入，探索通过MSC转化为神经干细胞恢复小儿外科常见疾病（先天性巨结肠症）正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性。

美国«时代»周刊曾将人类胚胎干细胞（ES细胞）和胚胎生殖细胞（EG细胞）建系研究成功列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。

由此激发了人们对ES细胞，骨髓干细胞，神经干细胞定向分化的研究。

将MSC,神经干细胞定向分化，移植的研究引入到HD这一小儿外科常见病的治疗研究中，探索MSC，神经干细胞克隆、定向分化、移植对于HD治疗方法，可为发育生物学积累宝贵的资料；采用细胞工程原理和方法，通过MSC，神经干细胞移植重建HD病变段的正常神经支配方法的研究成功，在临床上将可以让HD患儿免于手术，使HD的治疗发生根本性的改观。

该课题的完成除能为儿童的健康成长做出巨大贡献，并能带动本地区整个小儿外科水平的发展，提高本地区小儿外科在国内及国际上的地位，为祖国西部大开发战略的顺利进行贡献力量。

参考文献

（1）陈雷玲，胡廷泽，朗诗明，等。

320例先天性巨结肠症的诊断与治疗分析。

华西医科大学学报，2000，31

（2）：

274-27

（2）KathrynS.Embryonicstemcellsusedtoremyelinateinjuredratspinalcordneurons.Lancet,2000,355（9218）:

1890

（3）McCafferyP,DragerUC.Regulationofretiniocacidsignalingintheembryonicnervoussystem:

amasterdifferentiationfactor.CytokineGrowthFactorRev.2000,11（3）:

233-249

（4）NatarajanD,GrigoriouM,Marcos-GutierrezCV,etal.Multipotentialprogenitorsofthemammalianentericnervoussystemcapableofcolonizingaganglionicbowelinorganculture.Development,1999,126:

157-168

（5）刘平，卢亦成，朱诚。

中枢神经干细胞。

中华神经外科杂志。

2000，16（3）：

196-198

（6）WoodburyD,SchwarzEJ,ProckopDJ,etal.Aultratandhumanbonemarrowstromalcellsdifferentiateintoneurons.JNeurosciRes,2000,61（4）:

364-370

—3-3—

三、研究方案

1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

研究目标：

　　探索建立针对先天性巨结肠症的MSC，神经干细胞移植治疗方法。

研究内容：

1．MSC的分离，体外克隆；

2．MSC向神经干细胞的转化；

3．多种人工修饰条件下的神经干细胞在HD动物模型（lethalspottedrat,ls/ls）无神经节细胞肠段移植，定向分化；

4．鉴定神经干细胞移植后HD动物模型的消化道神经系统形态及机能。

拟解决的关键问题：

1．MSC向神经干细胞的转化；

2．神经干细胞的基因修饰；

3．神经干细胞移植，定向分化的分子机制。

－4－

2.

拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法：

1．无血清培养，单细胞克隆技术；

2．mRNA差异消减显示技术；

3．原位杂交；RT-PCR，免疫组化技术，透射电镜技术；

4．基因转染技术。

技术路线：

建立HD动物模型

MSC的分离及体外培养

MSC向神经干细胞的转化

神经干细胞体外培养，克隆（V-MYC，EGF等多种基因转染，修饰）

神经干细胞移植到HD动物无神经节细胞段

诱导分化（维甲酸等）

mRNA差异消减显示技术显示神经干细胞移植分化的分子机制

观察无神经节细胞段肠神经系统形态及功能

获得通过MSC、神经干细胞移植对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的方法

－5-1－

—5-2—

实验方案：

第一部分：

建立HD动物大鼠

参照文献进行大鼠选育，源于Wistar-ImamichiAR系，HD大鼠均结肠造瘘处理。

第二部分：

MSC分离培养，向神经干细胞转化

1.MSC分离培养切取鼠一侧股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取细胞培养液（DMEM/20FBS），反复多次冲洗出骨髓细胞，用吸管反复抽吸后，Ficoll分离液离心分离出有核细细胞，移入T-75培养瓶，过夜培养，第二日将悬浮细胞移去（贴壁细胞为较纯的基质干细胞），3-4天更换培养液，当细胞融合时用胰岛素/EDTA（trypsin/EDTA）处理，收获贴壁细胞为MSC（MSC鉴定选用CD29，CD90，CD106等标记）。

2.MSC向神经干细胞转化参照文献在MSC培养液中加入脊索中胚层浸出液，脊索中胚层条件培养液，星形胶质细胞上清液，多种神经生长因子等。

3.鉴定A.光镜及电镜下观察转化细胞形态改变。

B.免疫组化或流式细胞仪检测细胞转化后的表面标志:

nestin,波形蛋白，RC抗原。

第三部分：

神经干细胞分离提取，体外培养，基因转染

1.神经干细胞的分离和传代分别取鼠纹状体和孕鼠皮层组织，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，利用DMEM/F12（1:

1）加B27及bFGF无血清培养基进行原代培养，具体参见文献。

2.体外基因转染对于以上两种来源的神经干细胞采用脂质体介导基因转染技术，将V-MYC，EGF，及FGF-2，PA，MMPcDNA重组逆转录病毒载体导入神经干细胞，包括双基因及单基因转染的多种形式。

逆转录病毒载体pLNCXE由中国医学科学院分子生物学国家重点实验室提供。

E.coli质粒DNA大量制备、纯化和酶切参照Sambrook等的文献方法进行；按LipofectamineTM试剂盒说明进行转染实验。

第四部分：

神经干细胞在无神经节细胞段的移植，定向分化及检测

—5-3—

1.神经干细胞在HD动物模型体内移植按多种组合形式，利用毛细显微注射器将经多种形式基因转染的神经干细胞注射到HD无神经节细胞段；参考文献报道进行，将注射细胞浓度定为0.5-1cell/0.5ul。

2.移植后的神经干细胞在HD动物体内的分化诱导维甲酸等分化诱导剂处理，药物浓度选择参考文献。

3.移植后的神经干细胞对HD动物模型无神经节细胞段肠神经系统的影响检测　

A．实验动物的处理：

将实验组鼠（包括对照组）分别于不同时期断颈处死，如移植后4周，16周，32周。

取移植处肠组织进行检测，分别按进行检测的项目要求对样本进行处理。

Ｂ．光镜及电镜检测移植处组织形态学变化。

Ｃ．免疫组化技术：

检测神经细胞特异性烯醇化酶（NSE），Ｓ-100，GAFP等表达。

Ｄ．原位杂交，RT-PCR检测：

转染基因的表达（V-MYC，EGF等），原位杂交所需探针，RT-PCR引物可分别购自中山，GIBIC公司，按说明进行实验操作。

Ｅ．功能鉴定：

直肠测压技术，生物化学方法检测r-氨基丁酸，P物质等的合成。

4.神经干细胞移植，分化的分子机制参照文献利用mRNA差异消减显示技术显示以上多种形式神经干细胞移植，分化的差异基因，进而进行分级分段克隆。

A.神经干细胞移植处肠段及相同部位正常肠神经组织RNA的纯化：

利用肠道组织的剥片技术获取肠神经组织，立即置放于液氮中，-70保存。

氯仿法提取RNA，DNase

处理，紫外分光度计定量测定。

B.RT-PCR差异消减显示：

对分别将神经干细胞移植处肠段及相同部位正常肠神经组织分离扩增出cDNA，运用5、端帽子引物与3、端锚定引物，对cDNA进行大量扩增，正常肠神经组织用生物素标记的dATP和dNTPs进行PCR扩增，产物进行消减杂交，用连亲和素去除共有产物，剩下的产物由带有[-32P]dATP的dNTPs进行PCR，在重复差异显示，回收差异条带并克隆。

（0.4ulRNA，1逆转录缓冲液，15umol/LdNTP,10umol/L简并引物，65。

C5min，37。

C温育10min，加200U/ulMoMuLV反转录酶，37。

C温育50min，95。

C温育5min，PCR，消减杂交，过柱子，PCR，消减杂交，TA克隆盒进行DNA克隆，按说明进行，及进行测序，基因鉴定等）。

5.结合步骤3的检测结果再进行神经干细胞的基因转染同第三部份的体外基因转染。

6.获得神经干细胞基因转染，移植，分化，重建HD正常神经支配的方案重复步骤1；2；3；4，反复调整。

第五部分：

统计分析

各实验组间的数据以均数标准差表示，用F检验，t检验，多因素方差分析进行多组及组间统计学处理，P值小于0.05为差异显著。

可行性分析：

（1）MSC分离，体外培养，本课题组已经完成。

（2）本课题组已前期进行了MSC转化为神经干细胞的实验，同时成功进行了体内神经干细胞的分离并获得了国家自然科学基金支助（编号30070382）。

（3）神经干细胞移植为当今各国神经细胞工程研究重点，大量的研究文献报道了神经干细胞分离，培养的方法。

（4）较其它一些干细胞研究不同，神经干细胞有明确的免疫标记。

（5）在临床及研究中对大量先天性巨结肠症进行了观察，有多篇相关文献发表。

（6）课题组已成功进行了神经干细胞的分离培养与鉴定，及成人骨髓MSC体外扩增和定向诱导分化为骨和软骨细胞。

－5-4－

3．本项目的创新之处

（1）以往对神经干细胞移植的研究主要局于中枢神经系统及脊髓损伤修复方面，虽然有类似于神经干细胞的神经嵴细胞修复肠神经节缺如的文章报道，但神经干细胞移植修复肠神经节缺如尚未见报道。

（2）首次提出MSC转化为神经干细胞后，移植分化修复HD正常神经支配可能。

4.年度研究计划及预测进展

（1）2002年1月~2002年12月

构建HD动物模型及初步完成MSC分离，体外培养，及向神经干细胞转化。

（2）2003年1月~2003年12月

完成神经干细胞的各种基因转染实验，初步完成HD动物模型的无神经节细胞段的神经干细胞注射及检测。

（3）2004年1月~2004年6月

进一步完成HD动物模型的无神经节细胞段的神经干细胞注射及检测，获得MSC转化为神经干细胞后移植分化重建HD正常神经支配的方法。

（4）2004年6月~2004年12月

数据处理，完成论文。

5.预期研究成果

以论文发表作为研究成果。

－6－

四、研究基础

1.与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩

（1）本项目的提出源于课题组对先天性巨结肠症长期的临床及基础研究，既往主要将注意力集中在手术方法的改进，病理生理学变化观察上，已有多篇相关文章发表。

（2）本课题组对多个年龄组的正常个体及先天性巨结肠症患者进行了神经节发育观测，并对人巨细胞病毒与先天性巨结肠症的关系进行了研究。

（3）对数百例先天性巨结肠症患者进行了诊治，有较丰富的临床经验。

（4）已成功地建立了神经干细胞的培养。

（5）本课题组成员已进行了MSC转化为神经干细胞的实验，并获得了国家自然科学基金资助（编号30070382）。

（6）本课题组较熟练地掌握了基因转染技术，效果优良。

2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况）

本研究室所在的重庆医科大学儿科研究所为原四川省重点实验室，现已重新评定为重庆直辖市重点实验室，目前正在申报国家级及教育部重点实验室，是博士授权点并可培养博士后人员。

有高级职称人员100多人。

儿科研究所专业门类齐全，技术力量雄厚，设备完善，具有包括中心实验室在内的涉及分子生物学、分子遗传学、细胞生物学、组织病理学、生物化学、免疫学、微生物学以及急救医学、小儿肿瘤实验外科学等专业实验室、研究室十余个，能承担国家重点科研课题及博士后研究工作。

多年来，已完成包括国家自然科学基金资助项目在内的部、委、省、市级科研课题上百项，并获多项各级奖励。

主要设备