植物组织培养实验指导Word文档格式.docx
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五、注意实验室安全，易燃易爆品的操作应远离火源。
六、实验结束，由实验指导教师和管理人员检查清点仪器设备，学生应办好交接手续，做好清洁卫生，及时关好水电阀门，保持实验室和仪器的清洁整齐。
组织培养实验室安全守则
实验室人员在工作的时候，要接触各种微生物、试样及检验过程中的物品，这些物质中有些对人体有毒害作用，有些还具有易燃易爆性质；
同时，各种仪器、电器、机械等设备，在使用中也可能存在危险性。
因此，作为实验室人员，必须遵守以下实验室安全守则。
（1）实验人员必须熟悉仪器、设备性能和使用方法，按规定要求进行操作；
（2）组织培养室应保持室内通风良好，避免不必要的污染；
（3）在无菌室操作时，必须穿工作服、戴工作帽及口罩，使用前必须经紫外线照射或其他方法消毒，才可使用，操作必须严格无菌操作，以免污染；
（4）在无菌室的超净工作台使用后，必须用酒精消毒手和台面，然后开紫外线照射20分钟；
（5）不使用无标签（或标志）容器盛放的试剂、试样；
（6）实验中产生的废液、废物应集中处理，不得任意排放；
所用的培养物、被污染的玻璃器皿，都必须用消毒水泡过夜或煮沸或高压蒸汽灭菌等方法处理后再清洗；
（7）在实验室中使用手提高压灭菌锅时，必须熟悉操作过程，操作时不得离开，时刻注意压力表，不得超过额定范围，以免发生危险；
（8）严格遵守安全用电规程。
不使用绝缘损坏或接地不良的电器设备，不准擅自拆修电器。
（9）实验完毕，实验人员必须洗手及消毒后方可进食，并不准把食物、食具带进实验室。
实验室内禁止吸烟。
（10）实验室应配备消防器材。
实验人员要熟悉其使用方法并掌握有关的灭火知识。
（11）实验结束，人员离室前要检查水、电、燃气和门窗，确保安全。
实验一植物组织培养实验室的参观与设计
一、目的要求
通过认知实习，了解植物组织培养实验室的布局，掌握植物组织培养的程序，同时熟悉组织培养中涉及的各种仪器设备和器皿用具。
二、仪器与用具
超净工作台、蒸馏水发生器或纯水发生器、高压灭菌器、普通冰箱、微波炉、煤气灶或电炉、显微镜、万分之一（或千分之一）电子天平、恒温箱、烘箱、各种培养器皿、分注器、各种实验器皿和各种器械用具。
三、方法步骤
1．集中学习组织培养实验室守则及有关注意事项。
2．由指导教师讲解植物组织培养的流程。
3．指导教师讲解组培实验室的构建情况，包括准备室、缓冲室、无菌操作室（又称接种室）和培养室的设计要求。
4．指导教师讲解仪器设备的名称、用途及使用方法。
5．指导教师讲解在实验室中培养材料的一些常用参数，如培养间的温度、光照时数、光照度等。
四、实训报告
1．植物组织培养实验室一般由几部分构成？
各个部分的功能主要有哪些？
2．植物组织培养常用的设备有哪些？
3．每人设计一个植物组织培养实验室的组建方案。
实验二培养器皿的洗涤
了解各种洗涤液的特性，掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器皿的洗涤技术。
二、基本原理
由于组织培养过程中器皿的重复利用，特别是培养基中有机物质及培养组织分泌物的附着，影响再次培养，导致实验结果发生误差，甚至使培养组织受到毒害。
同时，一些新制玻璃器皿，都部分的存在碱性游离物，也影响到实验结果的准确性。
因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，使其达到不留任何残留物的要求。
因不同培养器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗的方法也不同。
三、试剂与主要用品
1．仪器用具毛刷、塑料盆、天平、量筒、烧杯、洗耳球、洗刷装置（全自动洗涤机）、高压灭菌器、耐酸手套、玻棒、需洗涤器皿等。
2．试剂肥皂粉、洗衣粉、去污粉、洗洁精、重铬酸钾、浓硫酸、蒸馏水、纯乙醇或95%的乙醇等。
四、操作步骤
（一）玻璃器皿的洗涤（酸洗）
玻璃器皿的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。
1．浸泡新的或用过的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，以软化和溶解附着物。
新购置的玻璃器皿含有游离碱，应先用自来水简单冲洗，再用1%～5%的HCl浸泡过夜；
用过的玻璃器皿往往附着有大量有机物质及培养组织的分泌物，干涸后不易涮洗掉，故用后应立即浸入清水中以备刷洗；
被杂菌污染的培养瓶或培养皿等玻璃器皿，应先高压灭菌20min，倒掉污染的培养基后，再浸入清水中浸泡以备刷洗。
2．刷洗将浸泡后的玻璃器皿放入肥皂液或洗衣粉液中，用毛刷反复刷洗，刷洗中要不留死角，并防止破坏玻璃表面的光洁度。
将刷洗过的玻璃器皿冲洗干净、晾干，准备浸酸。
3．浸酸将上述玻璃器皿浸泡到重铬酸钾洗涤液（又称酸液）中，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面残留的物质。
根据洗涤液中含硫酸的比例，将洗涤液分为强酸，次强酸和弱酸三种（表2-1）。
根据需要配制洗涤液，洗涤液对玻璃无腐蚀作用，去污效果好，用其洗是保证器皿洁净的关键一环。
配制洗涤液时，操作者必须小心认真，戴耐酸手套和防护眼镜，并严格按下列方法进行。
表2-1重铬酸钾洗涤液的配方
成分
强液
中液
弱液
重铬酸钾（g）
H2SO4（ml）
蒸馏水（ml）
63
1000
200
120
100
（1）按配方称量好重铬酸钾和蒸馏水，然后将重铬酸钾完全溶于蒸馏水中（可加热）。
（2）按配方把工业用浓硫酸缓慢（以产热很少为宜）加入冷却的
（1）中，边加边搅拌。
（3）自然冷却、备用。
洗涤液为强氧化剂，去污力强，可以洗去玻璃器皿或瓷质器皿上的有机物，切不可洗涤金属器皿。
配制、盛装洗涤液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。
洗涤液在使用过程中和使用后都应保持密闭，防止氧化变质。
新配制的洗涤液呈棕红色，当使用时间过久，洗涤液的颜色变暗、发绿或浑浊时，应弃去（深埋地下），重新配制新的洗涤液。
一般来说，新的和用过的玻璃器皿都应浸酸，那些无法用毛刷刷洗的用品（如吸管、滴管等）更要靠浸酸去除污物。
浸酸时，器皿应完全被洗涤液充满和覆盖。
浸酸时间不少于6h，一般要过夜或更长时间。
将器皿放入洗涤液时，应小心操作，防止伤及皮肤、眼睛或衣服。
从洗涤液中取出器皿时，应沥干洗涤液，并将浸酸的器皿放入合适的容器，如塑料盆中运输。
4．冲洗刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到组织培养的成败。
冲洗可用洗涤装置，也可手工操作。
手工洗涤浸酸后的器皿时，每件器皿都至少要重复“注满水——倒空”15次以上，最后用蒸馏水浸洗2～3次，晾干或烘干后包装备用。
载玻片与盖玻片的洗涤：
先用流水冲洗，再将其浸入含有1%～2%盐酸的95%乙醇液中浸泡6～12h，流水冲洗后再浸入加了1～2滴氨水的80%的乙醇中1h，取出用绸布擦干，保存在载玻片盒或培养皿中备用。
（二）橡胶制品的清洗
新购置的橡胶制品（如胶管，胶塞，橡皮乳头等）的洗涤方法如下：
0.5mol/L的NaOH煮沸15min-→流水冲洗-→0.5mol/LHCl煮沸15min-→流水冲洗-→自来水煮沸2次-→蒸馏水煮沸20min-→50℃烘干备用。
用过胶塞的洗涤方法基本同玻璃器皿，但胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，应逐个刷洗。
（三）塑料制品的清洗
塑料制品的特点是：
质地软，易出现划痕；
耐腐蚀能力强，但不耐热。
其清洗程序为：
使用器皿后立即用流水冲洗-→浸于自来水中过夜-→用纱布或棉签蘸50℃洗涤液的刷洗-→流水冲洗-→晾干-→浸于洗涤液中15min-→流水冲洗15～20遍-→蒸馏水浸洗3次-→晾干备用。
（四）大量培养瓶的清洗（碱洗）
在规模化的组织培养生产中，对大量的培养瓶用洗衣粉进行洗涤后，用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2～3次即可，将瓶倒置晾干备用。
被杂菌污染的培养瓶等玻璃器皿，应先高压灭菌20min，倒掉污染的培养基后，再按照上述方法洗涤。
五、实训报告
1．各种培养容器、器皿洗涤方法有何不同？
2．碱洗、酸洗的作用是什么？
配制酸液时应该注意哪些事项？
实验三植物组织培养中常用设备和仪器的使用
通过实训，使学生掌握植物组织培养的主要设备和仪器的使用方法、操作规程及保养方法等。
二、仪器和设备
电子分析天平、超净工作台、高压灭菌器、酸度计等。
（一）电子分析天平（感量0.0001g）
以FA/JA型多功能电子天平为例说明电子天平的使用方法，这里重点介绍几个常用功能键的操作方法。
1．天平的放置天平应置于稳定的工作台上，避免震动、阳光照射和气流干扰。
2．操作方法
（1）天平调平在使用前观察水平仪，如水平仪水泡偏移，需调整水平节脚，使水泡位于水平仪中心。
（2）开机接通电源。
天平通电后就开始工作（显示器未工作），通常需预热以后，方可开启显示器进行操作使用。
（3）开启显示器键（ON）只要轻按一下ON键，显示器全亮“±
8888888%”对显示器的功能进行检查，约2秒后显示天平的型号，例如：
“-1004-”，然后是称量模式“0.0000g”。
（4）清零、去皮键（TAR）置称量容器或称量纸于秤盘上，显示出容器或称量纸的质量，然后轻按TAR键，显示消隐，随即显示“0.0000g”，容器或称量纸质量值已去除，即去皮重。
（5）称量用试剂勺轻轻将试剂置于称量容器或称量纸中，称取所需要的量。
试剂不可掉在容器或称量纸外。
（6）关闭显示键移去称量容器或称量纸，轻按OFF键，显示器熄灭，清扫电子天平。
若要较长时间不再使用天平，应从电源插座上拔下插头。
（二）梅特勒-托利多320pH计
1．设置校准点要获得最精确的pH值，必须周期性的校准电极。
320pH计允许选择一组（三种）校准缓冲液。
校准时可采用所选之缓冲液组中的两种溶液。
有三组缓冲液供选择：
组1（b=1）：
pH4.00、7.00、10.00；
组2（b=2）：
pH4.01、7.00、9.21；
组3（b=3）：
pH4.01、6.86、9.18。
按下列步骤选择校准缓冲液：
按“on/off”关闭显示屏。
按住“mode”且再按“on/off”。
松开“mode”显示屏显示b=1（或选择的缓冲液组）。
按“cal”显示b=2，或b=3，按“read”在缓冲液组显示时选择合适的组别。
即使断电，320pH计也可保留此项设置，不需要经常进行此项设置。
2．校准pH电极如果使用ATC探测器（或含ATC的电极），缓冲液温度会被测定并补偿。
如果不使用ATC探测器，320pH计则认为温度是25℃。
第一点校准：
选用与pH7接近的缓冲液校准第一点，将电极放入第一个缓冲液并按“cal”，320pH计在校准时自动确定终点（即显示该缓冲液的pH值），要人工定义终点，按“read”，当到达终止时指示器显示相应的缓冲液pH值。
第二点校准：
应使用与被测样品接近的缓冲液进行第二点校准操作。
因植物组织培养的培养基大多数pH范围为5.5～6.0，因此宜选用4.00（或4.01）的缓冲液。
将电极放入第二种缓冲液，按“cal”，并按第一点校准步骤操作。
当显示静止时电极斜率值会简要显示。
注意：
校准pH电极的两种缓冲液pH应与设置的校准点缓冲液一致。
例如：
设置校准点为组3（b=3），则校准pH电极第一点时缓冲液应为pH6.86，第二点时缓冲液应为pH4.01。
3．测定pH值要测定某一样品的pH，将电极放入样品中并按“read”启动测定过程，小数点会闪动。
显示屏同时显示数字式及模拟式pH值。
4．注意事项
（1）在使用电极之前，将保湿帽从电极头处拧去，并将橡皮帽从填液孔上移走。
（2）在将电极从一种溶液移入另一溶液之前，需要用蒸馏水或下一个被测溶液清洗电极，用吸水纸将水吸干，切勿擦拭电极，否则会产生极化和反应迟缓现象。
（3）小心使用电极，切勿将之用作搅拌器。
在拿放电极时勿触碰电极膜。
电极膜的损伤会导致精度降低和反应迟缓现象。
（4）测定小体积样品时，请确保液体连接部能被浸没。
（5）使用结束时，电极需在填充液内保存，不能使其干燥！
（三）立式压力蒸汽灭菌器
1．结构与特点以上海医用核子仪器有限公司生产的LS-B50L型立式圆形压力蒸汽灭菌器为例说明其使用方法。
灭菌器内装电加热器、灭菌计时器、压力温度自动控制调节器、安全阀、放汽阀、压力温度指示表以及灭菌结束报警器和自动切断加热电源等装置。
2．高压灭菌器操作程序加水-→放置需灭菌器物-→密封-→预置灭菌温度-→设置灭菌时间-→加热（排放冷空气）-→灭菌-→结束。
（1）加水。
打开灭菌器盖，取出灭菌桶，向灭菌容器内注入清洁软化水，水位应浸没容器内水位标志。
（2）堆放。
将被灭菌之物包扎好后，顺序放置在灭菌桶内的筛板上，包与包之间必须留有适当的空隙。
（3）密封。
灭菌桶放入主体后，将灭菌器盖盖好，按顺序将相对方位的紧固螺栓予以均匀地旋紧，使盖与桶体密合，不宜旋得太紧，以免损坏橡胶密封垫圈。
打开放汽阀，安全阀不可打开。
（4）预置灭菌温度。
预置灭菌温度是通过压力——温度控制器旋钮预置，温度预置范围109℃～126℃。
顺时针方向旋转钮，灭菌温度预置值减小，反之，预置值增大。
满刻度值为126℃，可根据需要预置灭菌温度（见图3-1）。
（5）设置灭菌时间。
按照不同的灭菌物品，将计时器旋钮按顺时针方向旋至所需的时间刻度上。
培养基常用的灭菌时间为20min。
图3-1灭菌器上的压力控制器、定时器、防汽阀
（6）加热—排冷空气。
首先合上漏电过载保护器开关，将电源按至“开”位置，电源指示灯亮，灭菌器进入等待状态，当预置灭菌温度，预置灭菌时间后，灭菌器自动进入加热程序。
“加热”指示灯亮，电热管工作。
开始加热时应将放汽阀扳手拨至放汽位置（见图3-1），使灭菌器内冷空气排放，待有较急促的蒸汽喷出时，将扳手拨至关闭位。
此时压力表随着加热逐渐上升，指示出灭菌器内的压力。
（7）灭菌。
当灭菌器内蒸汽压力、温度升至预置灭菌温度值时，加热灯由“亮”变“熄灭”，同时计时指示灯“亮”，灭菌计时器自动进入并自锁，开始计时。
此时应微调压力——温度控制器，使灭菌器压力——温度值达到预置值，确保灭菌效果。
在预置灭菌时间内自动进入恒温控制程序，电热管自动间歇工作。
待灭菌时间到达设置时间后，灭菌结束，蜂鸣器发出响声，自动切断加热控制电路。
（8）结束。
将“电源”接至“关”位置。
如消毒灭菌物品为溶液和培养基等，在灭菌结束后，切忌立即放汽，否则会由于压力突然降低而剧烈沸腾，导致瓶子破裂溶液溢出。
应让其自然冷却，容器内压力因冷却而下降至接近“零”位时，再将放汽阀打开，方能打开灭菌器盖取出灭菌桶。
3．注意事项
（1）在灭菌器开始加热时，必须将“放汽阀”扳至放汽位置，使灭菌器内的冷空气逸出，确保良好的灭菌效果。
（2）不同类型的物品最好不要同时灭菌，以免顾此失彼，造成损失。
被灭菌物品的溶液，应灌注在耐高温的玻璃瓶内，切勿灌注太满。
一般灌至瓶容积的1/2～3/4即可，且勿用没有通孔的瓶塞（如橡胶塞或软木塞等）。
（3）压力温度控制器一旦调定预置值后，一般来说，可重复使用，以后不必再重新调定，但要经常观察比值有否变动。
（4）过载漏电保护试验按钮具有用于检验该保护器是否能正常工作的功能。
此按钮平常不要经常使用，保护器开关也不能作为电源开关使用，以免影响保护器精度。
（5）其他厂家生产的高压灭菌器在使用方法上会有一些不同，使用前必须认真阅读使用说明书，或向实验指导教师请教，且不可盲目操作。
（四）超净工作台
1.结构与特点超净工作台是植物组织培养技术中常用的仪器，是提供局部无菌工作环境的空气净化设备。
工作台由机箱、高效过滤器、可变风量送风机组、工作台面、操作板等几大部件组成。
其工作原理是将室内空气经预过滤器过滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器过滤后从出风面吹出，形成洁净气流。
洁净气流以均匀的断面风速流经工作区，从而形成高洁净的工作环境。
2.使用操作
（1）新安装的或长期未使用的工作台，使用前必须用超净真空吸尘器或不产生纤维的物品认真进行清洁工作。
长期不使用的工作台应拔下电源插头。
（2）使用前应提前20min同时开启紫外灯和风机组工作，工作20min后关闭紫外灯。
要经常用75%乙醇将紫外灯表面和工作区的表面擦干净，保证其灭菌效率。
（3）工作台面上禁止存放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰。
（4）禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免做明显扰动气流的动作。
（5）当需要调节风机风速时，用工作台操作面板上的轻触型开关进行调节（按电压分为五档：
140V，150V，160V，180V，220V）。
风机调节电压指示由红、绿双色光排显示。
风速每递增一档，光排增加两格红色替代原来的绿色；
反之，风速每递减一档，光排增加两格绿色替代原来的红色显示。
（6）禁止在预过滤器进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风量减少，降低净化能力。
1.天平使用中应注意哪些事项？
2．pH计使用中应注意哪些事项？
3．高压灭菌器使用中应注意哪些事项，如何确定冷空气已排出？
4．超净工作台使用中，应注意哪些事项？
实验四植物组织培养基母液的配制和保存
学习植物组织培养基母液的配制，为培养基的配制做准备。
植物培养基是植物离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度按比例稀释。
本实训以MS培养基为例，学习培养基母液的配制。
三、试剂与主要用具
1．仪器、用具分析天平（感量0.01g和0.0001g）、药匙、玻棒、称量纸、吸水纸、滴管、洗瓶、标签纸、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、200ml、500ml、1000ml）、试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液管、洗耳球、电炉等。
2．试剂
（1）95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。
（2）MS培养基各成分试剂。
（3）植物生长调节剂：
2，4-D、6-BA、IAA、NAA等。
（4）洗涤剂。
四、方法步骤
1．大量元素母液的配制按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表4-1中的次序分别准确称量后，分别用50ml烧杯，加入蒸馏水30ml溶解（可以加热至60℃～70℃，促其溶解）。
溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。
将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，保存于4℃冰箱中待用。
表4-1MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量
母液
化合物名称
培养基用量
（mg/L）
扩大倍数
称取量（mg）
母液体积（mL）
1L培养基吸取母液量（mL）
大
量
元
素
KNO3
1,900
10
4,750
250
NH4NO3
1,650
4,125
MgSO4·
7H2O
370
9,25
KH2PO4
170
425
CaCl2·
2H2O
440
1,100
2.微量元素母液的配制按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100倍（表4-2），用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。
将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，于4℃保存。
表4-2MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量
称取量
（mg）
微
MnSO4·
4H2O
22.3
223
ZnSO4·
8.6
86
H3BO3
6.2
62
KI
0.83
8.3
Na2MoO4·
0.25
2.5
CuSO4·
5H2O
0.025
10ml*
CoCl2·
6H2O
10ml**
*、**：
因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取2.5g，溶解并定容至100ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。
3.铁盐母液的配制常用的铁盐是FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。
配制时，按照扩大后的用量（表4-3），分别称取FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA，分别溶解后，将FeSO4溶液缓缓倒入Na2-EDTA溶液（需加热溶解），搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，并保存于冰箱中。
表4-3MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量
培养基用量（mg/L）
母液体积
（mL）
铁盐
Na2-EDTA
37.3
373
FeSO4·
27.8
278
4．有机物母液的配制按照表4-4中各成分浓度扩大后的用量，用感量0.0001g天平分别称量各有机物。
可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。
一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用少量稀氨水或1mol/LNaOH溶液溶解；
VH（生物素）先用1mol/LNaOH溶液溶解；
VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。
表4-4MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量
有机物名称
有
机
物
甘氨酸
2.0
20
V
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