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生物信息学应用论文4000字

（一）：

结构生物信息学在肽体药物分子设计中的应用论文

摘要：

肽是人体七大营养素之一，具有抑制细胞变性、增强免疫力，激活细胞、清除自由基，修复变性细胞、促新陈代谢，维持细胞正常活动四大功效。

本研究概述了肽类药物分子设计的相关概述，进而设计出了一种基于结构生物信息学的纳米肽类药物，以为药物实现长时间血液循环、靶向性爆发释放、提升试剂装载率、降低毒副作用提供可行性借鉴。

关键词：

结构生物信息学；肽体药物；分子；设计

肽是人体七大营养素之一，具有抑制细胞变性、增强免疫力，激活细胞、清除自由基，修复变性细胞、促新陈代谢，维持细胞正常活动四大功效。

肽体药物的制备之于人类具有重要的科研价值。

从结构生物信息学的相关理论来看，肽体药物涵盖白蛋白、蛋白肽、羊胎素、干细胞、胰岛素、催产素、胸腺肽等多种物质，在疾病防控和治疗领域发挥了显著的功效。

1肽体药物概述

在过去的数十年间，肿瘤学治疗领域中诞生了以分子靶向药物的病因治疗机制革新和替代了非特异性化疗药物的治疗策略。

以肽类药物为例，通过药物制备环节分子设计，整体上实现了肿瘤微环境改善、阻断了肿瘤细胞或肿瘤特异性细胞表达，同时以高分子作用机制阻断肿瘤细胞恶性增殖、转移，促使其凋亡的尝试，一度成为结构生物信息学研究背景领域的关键性议题，并在现实实践中发挥了突出作用。

肽类药物分子设计主要通过智能超分子光动力纳米技术作用，在金属配位能力设计、装载效率、稳定性测试、血液循环时间、临床试验治疗疗效上发挥了特异性作用。

2设计细则

2.1设计背景

2018年5月，多家研究机构合作报道了Schlafen（SLFN）蛋白家族被发现20年以来的第一个晶体结构，证实SLFN是一个新型的核酸内切酶家族，通过破坏蛋白翻译机器调控真核生物的翻译进程，能够有效控制HIV病毒的复制和包装。

肽类药物分子设计正是基于小分子化合物与蛋白靶标的对接上，并在结果排序中得到充分验证。

自1980年以后，首个对接分子软件信息系统DOCK的运用，直接程度上在方法、虚拟筛选策略上达到了药物制备的设计需求。

故此，肽类药物的分子设计产物借助配位和多种弱的协同机制，整体上促进了药物的长效性、稳定性、靶向爆发式释放的形成；再者，还在制备方法上，以其便捷性、可操作性、高装载率和包封率，实现了药物的应用效果；三者，以结构生物信息学为基础的材料来源，更具生物相容性、药物多组分配位及其自组装制备成效及其应用前景极为广阔。

2.2设计对接点位

基于结构生物信息学的肽类药物制备中，主要通过了解蛋白结合位点、提升对接效率为准确性的前提。

具体包括应用计算方法预测指定口袋来确定蛋白-小分子复合物晶体结构中小分子的位点准确性。

小分子三维构象的采样和小分子在结合位点的构象、打分等之于小分子势能表面极小值点（低能）的构象，均可借助开源软件（RDKit，Frog2，Confab）等软件性能俩达到商业软件的媲美效果。

2.3设计模式选择

肽类药物分析设计结合模式为口袋结合模式，并成为分子对接的关键点。

主要手段为，依靠小分子和蛋白的药效团（pharmacophore）距离矩阵（配体）确定构象（映射口袋）；大的化合物库筛选主要通过他来实现。

模型构筑环节，还通过毒品片段小分子渐进式建模方法，稳定性生长配体分子。

设计方法还包括应用蒙特卡洛模拟和遗传算法等随机采样方法实现集成对接。

亲和性上，主要通过经验打分函数估算CTL表位肽来实现。

CTL对肿瘤特异性杀伤表现在对毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocyte，CTL）的杀伤作用上，并针对其活动物质发挥出了关键性作用。

2.4设计实现

以人含缬酪肽蛋白（VCp）ELISAkit为例，整体上以实验研究设计出了以结构生物信息学为基础的肽类药物分子的设计实现。

浓度：

1mg/ml

稀释方法：

a.实验前，将冻干粉抗体用无菌蒸馏水稀释（或PBS稀释），将稀释后的抗体分装5-10支（20ulx5支或10ulx10支），放入-20℃保存，使用环节即用即拿，避免反复冻溶。

b.实验前，可将冻干粉抗体用无菌蒸馏水稀释50ul（或PBS稀释50ul）成原液：

再加50%甘油，放入-20℃保存，视研究需要进行。

c.预试验梯度选择1：

100、200、400，选择最佳稀释比例，工作液选用抗体稀释液。

3基于結构生物信息学的肽体药物分子设计实现

肽体药物分子的筛查作为新药研发的关键，直接关乎是否符合结构生物信息学项目的生死。

具体应用设计实现流程为：

3.1确认肽体药物分子设计靶点

肽体药物制备工作的起点即确认靶点，并成为相关工作如期进展的有序保障。

基于结构生物学的肽体药物旨在疾病治疗，并融合基因序列晶体结构、基因组学和蛋白质组学等关键信息。

应用化合物库供应平台如陶素生化对已知肽体药物分子通路和靶点作为数据库筛查对象，由用户确认后，应用激酶库、GPCR库等工具对小分子靶点活性和功能进行初筛。

科学家以此为对象，发现肽类蛋白中的一个/几个蛋白对生物现象发生的直接刺激，进而对期间感兴趣的蛋白加以提炼。

例如：

含缬酪肽蛋白（valosin-containingprotein，VCP）即p97，是一种广泛存在的膜结合糖蛋白，在细胞活性中有着广泛的功能，其总的特点是作为类似分子伴侣的作用在内质网相关的蛋白降解及细胞周期调控中起重要作用。

如图1所示：

3.2小分子肽类化合物的发现和获得

小分子肽即超低分子量寡肽，系统构成包括2～4个氨基酸高活性肽，以洗化用品面膜生产中小分子肽类面膜为例，补水保湿效果显著高于玻尿酸。

从概念来讲，小分子肽作为氨基酸和蛋白质间的生化物质，具有分子量小、蛋白质片段的效果。

以氨基酸组合物>10的肽类化合物即为多肽，2-9个氨基酸组合物为寡肽，2-4个氨基酸组成的为小分子肽。

其最初发现，主要作用表现为蛋白质吸收分解后以氨基酸和小肽出现；与食品中的异体蛋白肽融合，重组分解为新的氨基酸和小肽来共同构筑人体蛋白质；基于结构生物信息学研究的肽类蛋白具有极高的氨基酸利用率并直接参与细胞的新陈代谢，逐渐以细胞生长、发育、生理功能发挥和分裂增殖为特性。

在人类吸收利用上，数量不同的氨基酸排列组合共同构筑了形态万千、功效不一的医用治疗药物，并以纳米技术为出发点的抗肿瘤药物在临床实践中发挥着越来越显著的临床效应。

针对特定靶标或作用环节的活性化合物，在主途径发现、随机筛选方案，基于肽类药物小分子设计的受体或配体结构和机制，药物研发环节往往采用虚拟筛选方式获得hit。

在获得途径上，主要基于纳米钛靶蛋白三维结构虚拟筛选、结合位点特征性质、药物与小分子化合物间的共生作用，以打分函数对蛋白和小分子化合物进行综合评价，预测得分、后续生物活性检测。

再者，受配体的虚拟筛选环节对小分子的利用，整体上在化合物形状相似性或药效团模型中以实验的形式得出最终研究成果。

具体如图2所示：

3.3分子结构筛选

基于分子结构的筛选和使用基于配体的方式进行筛选为化合物母核结构筛选中的最佳方案，并在分子化合物多样性、纯度、产品新颖度、类药性、候选药物获得上具有重要的临床价值。

临床实验的申请审批环节，还涉及CFDA审批药品临床试验批件、药检报告要符合规范、研究者手册、药物临床研究机构、研究人员、新药临床试验方案、可操作的标准操作规程（简称SOP）。

3.4临床实验与上市审批复核

一期实验阶段，要综合评价药物安全性和剂量，需健康志愿者为新药实验人员，即通过早期人体试验，衡量药物耐受程度、药代动力学结构、确定治疗试验；临床II期试验用药剂量要综合考虑肽类药物的药效或毒性与其所达到的浓度（如血液中的浓度）；临床III期临床试验研究设计和给药剂量方案，主要以随机盲法对照临床试验。

如在临床分子库中通过高通量筛选和高内涵筛选对已知肽类药物分子及其化合物进行集合；批准进入临床一期、二期、三期；配备详尽的化合物结构、靶点信息、IC50值、活性描述等；以NMR和HPLC技术满足高纯度药物制备要求。

4研究综述

以新型抗糖尿病分子设计为例，内涵含有尿嘧啶结构单元的二肽衍生物；主要原料来源——尿嘧啶、多聚甲醛和半胱氨酸；经两步反应获得关键中间体S-胸腺嘧啶-L-半胱氨酸（IM-2），再经氨基保护、羧基酯化和氨基酸偶联，顺利合成了16个二肽衍生物。

结果表明，该分子的α-葡萄糖苷酶抑制活性變化趋势与PPRE激动活性、DPP-4抑制活性变化趋势相反。

通过分析抑制剂胱氨酸结（inhibitorcystineknot，ICK）多肽和环形胱氨酸结（cycliccystineknot，CCK）多肽两类主要CK毒素的氨基酸序列、拓扑结构、排列组合、人工合成以及空间折叠等特征，阐述了其在药物设计与分子工程中的应用前景。

利用多肽自组装超分子体系实现药物对肿瘤微环境的响应释放和高效递送，并对其通过调控微环境中的血管、成纤维细胞和胞外基质等组分，构建表/界面性质可控的纳米药物系统，发展基于肿瘤微环境调控与联合治疗的肿瘤综合治疗方案。

提高光敏剂的肿瘤选择性，尤其是其肿瘤靶向输送的手段和方法，构筑新型纳米粒、脂质体、聚合物胶束、仿生型纳米系统等新式药物。

5结束语

上文总结了基于结构生物信息学视域的肽体药物分子结构设计，并在研究领域发挥了突出的作用和功效。

基于上述实验的优点，该肽类药物的制备具有广泛的应用前景。

尽管如此，该药物的设计实现，仍旧需要进一步调整，以在动物实验中加以印证，方便尽早应用于临床。

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（二）：

应用生物信息学方法筛选食管鳞癌的关键基因论文

[摘要]目的筛选食管鳞癌的关键基因，为肿瘤的发病机制研究提供新的思路。

方法检索GEO数据库中食管鳞癌基因表达芯片，分析差异表达基因并获得共同差异基因；利用在线数据库DAVID进行GO和KEGG通路富集分析；通过String数据库和Cytoscape软件分析获取链接度最高的10个关键基因，并在TCGA数据库中验证。

结果共筛选出204个差异表达基因。

GO分析显示其生物学过程富集在细胞分裂、细胞器断裂和细胞周期等163个条目中；细胞学组分富集在细胞外、细胞质和细胞器腔内等48个条目中；分子功能富集在调控肽酶活性、与细胞外基质结合等46个条目中。

KEGG通路富集在局部黏附、p53信号通路、错配修复等12个条目中。

筛选出10个链接度最高的Hub基因，且通过TCGA数据库验证其全部在食管鳞癌组织中高表达（P<0.01）。

结论CDK1、CCNA2、RFC4、CCNB1、TOP2A、AURKA、CDC6、BUB1、BUB1B、PLK1是食管鳞癌的关键基因，可能是食管鳞癌的生物标志和治疗靶点。

[关键词]食管鳞癌；关键基因；生物信息学；基因芯片

根據WHO统计，全世界每年约有40万人死于食管癌，其中我国约20万人，占世界的一半[1]。

食管癌主要有两个亚型——食管鳞癌和腺癌，我国食管癌患者主要为鳞癌。

目前食管癌的发生发展及转移机制尚不清楚，因此进一步研究其发病机制，建立有效的预防和诊疗方法，是迫切需要解决的问题。

本研究通过分析GEO数据库[2]中食管鳞癌的相关芯片数据，旨在挖掘食管鳞癌的关键基因，利用生物信息学方法探讨其可能的发病机制，为进一步的基础与临床研究提供方向。

1资料与方法

1.1一般资料

资料来源GEO在线数据库），下载食管鳞癌全基因组表达谱芯片数据集。

入选条件：

①全基因组RNA表达谱芯片；②人食管鳞癌组织与配对的癌旁正常组织。

1.2方法

1.2.1分析差异表达基因①数据预处理：

将下载的芯片数据导入R语言，经RMA法进行背景校正和矩阵数据归一化处理获得标准化芯片表达矩阵数据；②筛选差异表达基因：

使用“Limma”包[3]筛选差异倍数（FC）>2且P<0.01的数据作为有意义的差异表达基因，并使用“ggplot”包绘制火山图。

1.2.2共同差异表达基因将筛选出的各个基因芯片数据集的差异表达基因取交集，获得共同的差异表达基因。

1.2.3GO与KEGG通路富集分析将共同差异表达基因导入DAVID6.8分析工具（http：

//david-d.ncifcrf.gov）[4]，进行GO与KEGG通路富集分析[5]，条件设定为P<0.01，结果使用“ggplot2”包[6]绘制气泡图。

1.2.4PPI网络构建与关键基因分析将筛选出的共同差异表达基因通过数据库String11.0（http：

//www.string-db.org）进行蛋白互作PPI网络分析，结果导入Cytoscape软件的CytoHubba插件[7]，获取链接度最高的10个Hub基因。

1.2.5关键基因验证通过GEPIA（http：

//gepia.cancer-）[8]网站，验证这10个Hub基因在TCGA和GTEx[9]数据库的表达情况，确定食管鳞癌的关键基因。

2结果

2.1食管鳞癌芯片数据集筛选

通过GEO数据库共筛选出符合条件的数据集三组，分别为GSE23400[10]、GSE20347[11]和GSE17351[12]，样本均为食管鳞癌及其配对癌旁正常食管黏膜组织。

见表1。

表1食管鳞癌基因表达谱芯片数据集基本信息

2.2差异表达基因分析

分析各组芯片数据集差异倍数FC>2且P<0.01的差异表达基因。

见表2、图1。

表2食管鳞癌基因表达谱芯片数据集DEGs分析结果（个）

2.3共同差异表达基因

对三组数据集差异表达基因进行Venn交集[13]，共获得204个共同差异表达基因，其中上调的167个，下调的37个。

见图2。

2.4GO富集分析

将共同差异表达基因导入DAVID6.8进行GO富集分析，发现食管鳞癌共同差异表达基因主要富集在细胞分裂、细胞周期、有丝分裂等163个生物过程中；主要位于细胞质、细胞器腔内、细胞核等48个细胞学组分中；主要参与调控肽酶活性，与细胞外基质、结构特异性DNA结合等46个分子功能。

取统计学意义最为显著（P值最小）的前15个。

见图3（封三）。

2.5KEGG通路富集分析

共同的差异表达基因在KEGG通路方面主要富集在小细胞肺癌、癌症通路、局部黏附、细胞周期、DNA复制等12个条目中（图4，封三）。

2.6Hub基因筛选

通过分析工具String11.0对这些共同的差异基因构建PPI网络，再利CytoHubba插件，对其互作关系进行MCC算法分析，得到链接度最高的10个Hub基因（图5）。

链接度由高至低分别为CDK1、CCNA2、RFC4、CCNB1、TOP2A、AURKA、CDC6、BUB1、BUB1B、PLK1。

2.7关键基因在公共数据库中的验证

将筛选出的10个Hub基因通过GEPIA2网站验证，显示在TCGA和GTEx数据库中，相对于食管癌旁正常组织，10个基因在食管癌组织中均呈高表达状态（P<0.01）（图6），说明其是食管癌的关键差异基因。

3讨论

本研究分析GEO数据库中3个食管鳞癌全基因表达谱芯片数据，发现相对于配对正常食管黏膜组织，共有204个差异基因为3个芯片数据集共有。

对其进行GO功能注释发现其与细胞周期、有丝分裂、细胞黏附等生物学过程相关。

KEGG通路富集分析表明食管鳞癌与小细胞肺癌、膀胱癌可能具备相同的分子机制，提示其与细胞周期、局部黏附、p53信号通路等机制相关。

分析以上结果，发现GO与KEGG通路富集分析均提示细胞周期和细胞黏附可能与食管癌密切相关。

细胞周期与恶性肿瘤发生关系密切，细胞周期调控紊乱可以导致细胞失控性增殖，这也是恶性肿瘤最基本的生物学特征[14]。

p53信号通路参与细胞周期调控，诱导G1、G2期阻滞，这与肿瘤的发生、发展密切相关。

细胞黏附在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用，肿瘤细胞发生黏附特性的改变，使其易从原位细胞群中解黏附脱离出来，进入血液和淋巴循环系统，同时也使肿瘤细胞到达靶器官后，更容易与靶器官的基质黏附[15]。

所以通过公共数据库进行大数据挖掘与分析，为肿瘤发病机制的研究提供方向与思路是可行的。

通过构建PPI网络，得到10个核心差异基因：

CDK1、CCNA2、RFC4、CCNB1、TOP2A、AURKA、CDC6、BUB1、BUB1B、PLK1。

10个基因中，除RFC4、BUB1、BUB1B基因未见报道外，其余均已有相关报道。

CDK1在细胞周期中介导细胞从G2期进入M期，是参与细胞有丝分裂的主要因子[16]。

CDK1也是食管癌及癌前病变的诊断、预后标志物和潜在治疗靶点[17]。

CCNA2与CCNB1与CDK激酶相互作用，参与细胞周期调控[18]。

TOP2A在调节细胞周期和调节肿瘤增殖中起着重要作用，是各种肿瘤进展和预后的潜在生物标志物[19]。

AURKA是细胞周期正常发生的必需蛋白，该基因的突变与多种类型癌症发生有关，AURKA在乳腺癌、结肠直腸、前列腺癌等几种细胞系中过表达[20]。

本研究进一步验证了这10个基因在TCGA数据库中的表达情况，结果显示其在食管癌样本中全部高表达，表明它们可能是食管鳞癌的生物标志物。

虽然本项研究是一种倾向性研究，最终需要大量实验数据的证实，但也为食管癌的发病机制研究提供了基础信息和新的研究方向。