《GB食品安全国家标准+食品微生物学检验+创伤弧菌检验》标准全文及编制说明.docx
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《GB食品安全国家标准+食品微生物学检验+创伤弧菌检验》标准全文及编制说明
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验创伤弧菌检验
1范围
本标准规定了水产品中创伤弧菌（Vibriovulnificus）的检验方法。
本标准适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品中创伤弧菌的检验。
2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1恒温培养箱：
36℃±1℃。
2.2冰箱：
2℃～5℃、7℃～10℃。
2.3恒温水浴锅。
2.4均质器或无菌研钵。
2.5天平：
感量0.1g
2.6PCR仪。
2.7电泳仪或毛细管电泳仪。
2.8凝胶电泳成像系统或紫外检测仪。
2.9生物安全柜。
2.10高速离心机（最大转速至少15000r/min）。
2.11涡旋振荡器。
2.12微量可调移液器（量程2.5µL、10µL、100µL、1000µL）及配套吸头。
2.13pH试纸或pH计。
2.14无菌试管：
规格18mm×180mm和15mm×100mm。
2.15无菌吸管：
规格1mL（具0.01mL刻度）和10mL（具0.1mL刻度）。
2.16无菌锥形瓶：
容量250mL、500mL和1000mL。
2.17无菌培养皿：
直径90mm。
2.18无菌手术剪、镊子、钳子等。
2.19PCR反应管。
3培养基和试剂
3.1蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多粘菌素E（PNCC）增菌液：
见附录A中A.1。
3.2纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂：
见附录A中A.2。
3.3改良纤维二糖-多粘菌素-多粘菌素E（mCPC）琼脂：
见附录A中A.3。
3.43%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：
见附录A中A.4。
3.5磷酸盐缓冲液（PBS）：
见附录A中A.5。
3.63%氯化钠三糖铁琼脂：
见附录A中A.6。
3.7嗜盐性试验培养基：
见附录A中A.7。
3.83%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：
见附录A中A.8。
3.93%氯化钠MR-VP培养基：
见附录A中A.9。
3.103%氯化钠溶液：
见附录A中A.10。
3.11氧化酶试剂：
见附录A中A.11。
3.12革兰氏染色液：
见附录A中A.12。
3.13邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）试剂：
见附录A中A.13。
3.14Voges-Proskauer（V-P）试剂：
见附录A中A.14。
3.15细菌DNA提取试剂盒。
3.16生化鉴定试剂盒。
3.17PCR反应配套试剂。
3.18琼脂糖凝胶电泳配套试剂。
3.19具有菌种保藏资质单位提供的创伤弧菌标准菌株。
4检验程序
创伤弧菌检验程序见图1。
36℃±1℃，18h±1h
阳性者
图1创伤弧菌检验程序
5操作步骤
5.1样品制备
5.1.1新鲜样品采集后应于3h内完成检验，若不能立即检验，则将样品置于7℃～10℃冰箱（因创伤弧菌在4℃条件下极易形成活而不可培养的状态，因此样品勿放4℃）保存，并尽可能在24h内完成检验；冷冻样品应在不超过45℃的温热条件下解冻不超过15min。
5.1.2取样
鱼类和头足类取其表面组织、肠和鳃，贝类则取全部内容物（包括贝肉和体液）。
甲壳类取整个动物或其中心部分（包括肠和鳃）。
如为带壳贝类或硬壳甲壳类，则应先用流动自来水冲洗外壳并用滤纸吸干表面水分，然后无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。
5.1.3以无菌操作取经上述处理后的样品不少于25g，用旋转刀片式均质器8000r/min～10000r/min均质1min，或用拍击式均质器均质1min～2min后，取25g样品匀浆液置于均质袋中，加入PNCC增菌液225mL，充分混匀制备成1:
10的样品匀液。
如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中充分研磨，取磨碎后的样品25g转入500mL无菌锥形瓶中，加入PNCC增菌液225mL，充分振荡混匀，制备成1:
10的样品匀液。
5.2增菌
将5.1.3制备的1:
10样品匀液于36℃±1℃培养18h±1h。
5.3PCR初筛
PCR实验环境条件和过程控制应参照GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》规定执行，下同。
5.3.1DNA模板的制备
吸取1mLPNCC增菌液于1.5mLEP管中，9000r/min离心3min，弃去上清液。
向沉淀中加入1mLPBS将其悬浮并充分清洗后，9000r/min离心3min，弃去上清液，按此步骤反复清洗沉淀2-3次，弃去最后一遍上清液，加入1mL无菌超纯水，100℃煮沸10min，继而12000r/min离心5min，上清液用于PCR分析。
若不能及时分析则于-20℃保存备用。
也可以用商品化的DNA提取试剂盒按其说明书要求提取制备DNA模板。
5.3.2PCR扩增
（1）引物
信息见表1。
表1.创伤弧菌PCR检测用引物信息
引物
序列
扩增片段长度
vvhA-785F
5'ccgcggtacaggttggcgca3'
519bp
vvhA-1303R
5'cgccacccactttcgggcc3'
（2）对照设置
每次PCR反应使用创伤弧菌标准菌株作为阳性对照，同时，使用除创伤弧菌之外的其他革兰氏阴性菌标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。
（3）PCR反应体系
见表2。
表2.创伤弧菌PCR检测反应体系组成
试剂
反应体积（μL）
无菌超纯水
13.7
10×PCR缓冲液
2.5
25mmol/LMgCl2
2.5
2.5mmol/LdNTP
2.0
上游引物（10μM）
1.0
上游引物（10μM）
1.0
DNA模板
2.0
5U/μLTaq酶
0.3
总体积
25.0
（4）PCR反应程序
预变性：
94℃、5min；变性：
94℃、1min，退火：
62℃、1min，延伸：
72℃、1min；循环数：
30；终延伸：
72℃，10min；电泳检测。
若不能立即检测则4℃保存备用。
5.3.3电泳
凝胶电泳检测PCR扩增产物。
用0.5×TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/mL或Goldview5μL/100mL），取5μLPCR扩增产物与1μL6×核酸电泳上样缓冲液混合后，点样，同时有一孔加入DNA分子量标准。
根据以下公式：
电泳槽正负极的距离（cm）×5V/cm计算并设置电压，使用0.5×TBE缓冲液恒压电泳，根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时间，使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。
也可采用毛细管电泳仪进行PCR扩增产物的检测。
5.3.4结果判定
质控系统：
阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（519bp）的扩增条带，则检测系统正常。
否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。
阳性结果：
在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阳性。
阴性结果：
在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阴性。
5.4分离
用10μL接种环在距离PNCC增菌液的液面下1cm沾取一环增菌液，分别划线接种于CC和mCPC平板，于36℃±1℃条件下培养18h±1h。
典型的创伤弧菌在CC和mCPC平板上的形态为：
圆形、扁平，光照下透明或中心不透明但边缘透明的黄色至橘黄色菌落，菌落直径1mm～2mm，菌落周围可出现（或不出现）黄色晕圈。
5.5分纯培养
从CC平板和mCPC平板上各挑取至少5个创伤弧菌可疑菌落（少于5个时全选），分别接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18h±1h后用于后续鉴定。
创伤弧菌在3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的菌落形态为圆形，乳白色，湿润，隆起，直径1mm～2mm。
5.6鉴定
创伤弧菌的鉴定可采用菌落特征结合生化特性、PCR方法中的其中之一进行。
5.6.1菌落特征及生化特性
5.6.1.1初步鉴定
该步骤用于创伤弧菌的初步鉴定，进行以下四项鉴定实验时，挑取的菌落应来自分纯后的同一个单菌落，其中任一项鉴定为阴性者无需进行后续确证试验。
革兰氏染色镜检：
从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落进行革兰氏染色并镜检。
创伤弧菌为革兰氏阴性，显微镜下菌体为棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞。
氧化酶试验：
用接种环从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适量，涂布在用氧化酶试剂湿润（如无菌滤纸）或滴有氧化酶试剂的白色或无色载体（如载玻片）上。
如果涂菌部位在10s之内变紫色（偶有蓝紫色），即为氧化酶试验阳性，不变色为氧化酶试验阴性。
创伤弧菌为氧化酶试验阳性。
三糖铁试验：
用接种针从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适量，转种于3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层（注意接种针不要触及试管底部），36℃±1℃培养24h观察结果。
创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂斜面中生长时试管底层变黄，无气泡，斜面颜色变黄（偶有斜面颜色不变黄的现象）。
嗜盐性试验：
用接种针从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落，分别接种于含0%、3%、6%、8%和10%氯化钠的胰胨水中，36℃±1℃培养24h，观察液体的混浊情况。
创伤弧菌在含0%、8％和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，胰胨水澄清透亮或稍混浊，而在含3%、6%氯化钠的胰胨水中生长旺盛，胰胨水混浊。
5.6.1.2确证实验
将初步鉴定为创伤弧菌的疑似菌落接种在3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上，36℃±1℃培养18h±1h后，取纯培养物分别接种于含3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基和MR-VP培养基中，36℃±1℃培养24h~48h后观察结果；另取少许纯培养物接种于3%氯化钠三糖铁琼脂斜面，36℃±1℃培养18h后用于ONPG试验。
也可选择生化鉴定试剂盒进行鉴定。
创伤弧菌生化特性见表3，与其他弧菌的鉴别见表4。
表3创伤弧菌生化特性
试验项目
结果
革兰氏染色镜检
阴性，无芽胞
氧化酶
＋
动力
＋
D-纤维二糖
＋
蔗糖
－
葡萄糖
＋
分解葡萄糖产气
－
乳糖
＋/－
硫化氢
－
赖氨酸脱羧酶
＋
V-P
－
ONPG
＋
注：
＋阳性；－阴性。
表4创伤弧菌主要生化特性与其他弧菌的比较鉴别
名称
氧化酶
赖氨酸
精氨酸
鸟氨酸
明胶
脲
酶
V
︱P
42
℃
蔗糖
D
︱
纤
维
二
糖
乳糖
阿拉伯糖
D
︱
甘
露
糖
D
︱
甘
露
醇
ONPG
嗜盐性试验
NaCl含量（%）
0
3
6
8
10
创伤弧菌
V.vulnificus
＋
＋
－
V
＋
－
－
＋
－
＋
＋/－
－
＋
V
＋
－
＋
＋
－
－
副溶血性弧菌
V.parahaemolyticus
＋
－
＋
＋
＋
V
－
＋
－
V
－
＋
＋
＋
－
－
＋
＋
＋
－
溶藻弧菌
V.alginolyticus
＋
＋
－
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
－
－
－
＋
＋
＋
霍乱弧菌
V.cholerae
＋
＋
－
＋
＋
－
V
＋
＋
－
－
－
＋
＋
＋
＋
－
－
－
－
拟态弧菌
V.mimicus
＋
＋
－
＋
＋
－
－
＋
－
－
－
－
＋
＋
＋
＋
－
－
－
－
河弧菌
V.fluvialis
＋
－
＋
－
＋
－
－
V
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
－
－
＋
V
－
弗氏弧菌
V.furnissii
＋
－
＋
－
＋
－
－
－
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
－
－
＋
＋
－
梅氏弧菌
V.metschnikovii
－
＋
＋
－
＋
－
＋
V
＋
－
－
－
＋
＋
＋
－
－
＋
V
＋
嗜水气单胞菌
A.hydrophilia
＋
V
＋
－
＋
－
V
V
＋
V
V
V
＋
＋
＋
＋
－
＋
－
－
类志贺邻单胞菌
P.shigelloides
＋
＋
＋
＋
－
－
－
＋
－
－
－
－
－
－
－
＋
－
－
－
－
注：
＋表示阳性，－表示阴性，V表示可变
5.6.2PCR鉴定
本部分试验可替代5.6.1用于创伤弧菌的快速鉴定。
5.6.2.1DNA模板的制备
从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落，转至500μL无菌超纯水中，充分混匀后制成肉眼可见的混浊菌悬液，煮沸10min、12000r/min离心5min，取上清液用于PCR分析。
若不能及时分析则于-20℃保存备用。
也可以用商业化的DNA提取试剂盒按其说明提取制备DNA模板。
5.6.2.2PCR扩增和电泳
同5.3.2和5.3.3。
5.6.2.3结果判定
质控系统：
阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（519bp）的扩增条带，则检测系统正常。
否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。
阳性结果：
在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阳性，该菌株是创伤弧菌。
阴性结果：
在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阴性，该菌株不是创伤弧菌。
5.7创伤弧菌分型（选做）
5.7.1DNA模板的制备
取鉴定结果为创伤弧菌的菌株制备DNA模板，制备方法同5.6.2.1。
5.7.2PCR扩增
5.7.2.1引物
PCR分型用引物信息见表5.
表5.创伤弧菌PCR分型用引物信息
目的基因
引物序列
片段长度（bp）
备注
vcgC
F:
5'agctgccgatagcgatct3'
R:
5'tgagctaacgcgagtagtgag3'
97
毒力相关基因vcg分型
vcgE
F:
5'ctcagaaaggctcaattgac3'
R:
5'gattaacgctgtaaggccg3'
199
16SrRNAA
F:
5'catgatagcttcggctcaa3'
R:
5'cactaccaccttcctcacgac3'
285
16SrRNA基因分型
16SrRNAB
F:
5'gcctacgggccaaagagg3'
R:
5'cctgcgtctccgctggct3'
839
SerE
F:
5'tgttgttcttgcccactctc3'
R:
5'cgcgcttagatttctctcacc3'
665
生物Ⅱ型和血清E型检测
Bt2
F:
5'agagatggaagaaacaggcg3'
R:
5'ggacagatataagggcaaatgg3'
344
5.7.2.2对照设置：
每次PCR反应使用含有目的基因的创伤弧菌标准菌株作为阳性对照，同时，使用除创伤弧菌之外的其他革兰氏阴性菌标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。
5.7.2.3PCR反应体系
同表2。
5.7.2.4PCR反应程序
预变性：
94℃、5min；变性：
94℃、1min，退火：
55℃（vcg基因）、58℃（16SrRNA基因）、64℃（Bt2基因及SerE基因）1min，延伸：
72℃、1min；循环数：
30个循环（vcg基因及16SrRNA基因），35个循环（Bt2基因及SerE基因）；终延伸：
72℃，5min；电泳。
若不能及时电泳检测，则将扩增产物于4℃储存。
5.7.3电泳
同5.3.3。
5.7.4结果判定
质控系统：
阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，则检测系统正常。
否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。
在质控系统正常的情况下，如果待测菌株出现97bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为vcgC型；如果出现199bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为vcgE型；
如果待测菌株出现285bp大小的条带则判定该株创伤弧菌为16SrRNAA型，如果出现839bp大小的条带则判定该株创伤弧菌为16SrRNAB型，如果同时出现285bp和839bp两条带，则判定该株创伤弧菌为16SrRNAA/B型；
如果待测菌株出现665bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为血清E型；如果待测菌株出现344bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为生物Ⅱ型。
6结果与报告
根据菌落特征、生化特性或PCR鉴定结果，报告25g样品中检出或未检出创伤弧菌。
附录A
培养基和试剂
A.1蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多粘菌素E（PNCC）增菌液
A.1.1溶液1
A.1.1.1成分
蛋白胨
50.0g
氯化钠
10.0g
蒸馏水
900.0mL
pH8.5±0.2
A.1.1.2制法
将A.1.1.1各成分溶于蒸馏水中，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5±0.2，121℃高压灭菌10min。
A.1.2溶液2
A.1.2.1成分
纤维二糖
0.8g
多黏菌素E
1000U
蒸馏水
100.0mL
A.1.2.2制法
将纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
将溶液1与溶液2混合即为PNCC增菌液。
A.2纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂培养基
A.2.1溶液1
A.2.1.1成分
蛋白胨
10.0g
牛肉粉
5.0g
氯化钠
20.0g
溴麝香草酚蓝
0.04g
甲酚红
0.04g
琼脂
15.0g
蒸馏水
900.0mL
pH7.6±0.2
A.2.1.2制法
将A.2.1.1中的各种成分溶于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6±0.2，冷却至48℃～55℃备用。
A.2.2溶液2
A.2.2.1成分
纤维二糖
10.0g
多黏菌素E
400000U
蒸馏水
100.0mL
A.2.2.2制法
将纤维二糖溶于100.0mL蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
将溶液2与溶液1混合后倾注平板。
A.3改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂培养基
A.3.1溶液1
A.3.1.1成分
蛋白胨
10.0g
牛肉粉
5.0g
氯化钠
20.0g
溴麝香草酚蓝
0.04g
甲酚红
0.04g
琼脂
15.0g
蒸馏水
900.0mL
pH7.6±0.2
A.3.1.2制法
将A.3.1.1中的各种成分溶于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6±0.2，冷却至48℃～55℃备用。
A.3.2溶液2
A.3.2.1成分
纤维二糖
10.0g
多黏菌素B
100000U
多黏菌素E
400000U
蒸馏水
100.0mL
A.3.2.2制法
将纤维二糖溶于100.0mL蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
将溶液2与溶液1混合后倾注平板。
A.43％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂
A.4.1成分
胰蛋白胨
15.0g
大豆蛋白胨
5.0g
氯化钠
30.0g
琼脂
15.0g
蒸馏水
1000.0mL
pH7.3±0.2
A.4.2制法
将A.3.1中的各种成分溶于蒸馏水中，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.3±0.2，121℃高压灭菌15min。
A.5磷酸盐缓冲液（PBS）
A.5.1成分
磷酸二氢钾（KH2PO4）
34.0g
蒸馏水
500.0mL
A.5.2制法
贮存液：
称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500.0mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液（约175mL）调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000.0mL后于冰箱贮存备用。
稀释液：
取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000.0mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
A.63％氯化钠三糖铁琼脂斜面
A.6.1成分
蛋白胨
15.0g
胰蛋白胨
5.0g
牛肉粉
3.0g
酵母粉
3.0g
氯化钠
30.0g
乳糖
10.0g
蔗糖
10.0g
葡萄糖
1.0g
硫酸亚铁（FeSO4）
0.2g
酚红
0.024g
硫代硫酸钠（Na2S2O3）
0.3g
琼脂
12.0g
蒸馏水
1000.0mL
pH7.4±0.2
A.6.2制法
将A.4.1中的各种成分溶于蒸馏水中，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4±0.2。
121℃高压灭菌15min后分装于试管中，制成斜面长4cm～5cm、深度2cm～3cm的高层斜面备用。
A.7嗜盐性试验培养基
A.7.1成分
胰蛋白胨
10.0g
氯化钠
按浓度不同依次加入相应量
蒸馏水
1000.0mL
pH7.2±0.2
A.7.2制法
将A.5.1中的各种成分溶于蒸馏水中，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2±0.2后，分装到300mL三角瓶中，每瓶100mL，共配置5瓶，分别加入不同量的氯化钠：
（1）0g；
（2）3g；（3）6g；（4）8g；（5）10g。
继而将各个浓度氯化钠溶液分装至适当容量的试管中，每管10mL，121℃高压灭菌15min备用。
A.83％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基
A.8.1成分
蛋白胨
5.0g
酵母粉
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