Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜.docx
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WesternBlot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜
WesternBlot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜
PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。
容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。
水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。
Cambrex（原来的FMC）有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。
更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razorsharp"啊！
平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！
如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！
什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！
Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。
可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？
上样电泳：
上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。
其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。
当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。
电泳结果检查：
如果要做WesternBlot，是否需要先检查电泳结果呢？
能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。
考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。
银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。
可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的WesternBlot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。
如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPROTangerine——这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。
可惜SYPROTangerine价格挺贵的，500ul（5000x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。
所以最经济实惠的方法是：
丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。
丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。
转膜：
经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行WesternBlot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。
在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。
WesternBlotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。
因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实验。
WesternBlot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（NitrocelluloseBlottingMembranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
具体哪种膜适合于哪些实验呢？
选择的根据主要有：
a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。
首先来比较下这几种膜的特点
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NC膜
尼龙膜
PVDF膜
灵敏度和分辨率
高
高
高
背景
低
较高
低
结合能力
80－110ug/cm2
>400ug/cm2
125－200ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）
材料质地
干的NC膜易脆
软而结实
机械强度高
溶剂耐受性
无
无
有
操作程序
缓冲液润湿,避免气泡
缓冲液润湿
使用前100%甲醇润湿
检测方式
常规染色，可用放射性和非放射性检测
不能用阴离子染料
常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。
适用范围
0.45um一般蛋白
0.2um一分子量小于20kD蛋白
0.1um一分子量小于7kD蛋白
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸检测中）
糖蛋白检测和蛋白质测序
价格
价格较便宜
便宜
较贵
1.硝酸纤维素膜
硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。
NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。
转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，Schleicher&Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的WesternBlot结果。
不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。
选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。
另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。
另外提醒一句：
由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。
硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是Schleicher&Schull；Millipore；PALL，另外罗氏、Invitrogen、GE（Amersham）、SantaCruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。
Schleicher&Schull的名字拗口——那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同速度的上下往返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个提供硝纤膜的厂家依然广为人知，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：
Protrannitrocellulosemembrane和Optitrannitrocellulosemembrane。
前者Protran一直是Schleicher&Schull自豪的产品，这种“100%PureNitrocelluloseMembranes”。
一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。
如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。
而Protran在制作过程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。
除了这一点以外，Protran还有低背景、多孔径选择（0.45,0.2,0.1um）和保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年！
真是“路遥知马力”的典范）等优点。
但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTraceNTNitrocelluloseTransferMembrane。
Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果表面看起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增强这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗脱的实验。
不过有的使用过的人反应不如纯NC膜结合能力强。
NC膜除了一般的Discs、Rolls和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种方便顾客使用的“sandwich”三明治形，十分有趣。
说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就是将滤纸和NC膜纸套成滤纸—NC膜—滤纸的层迭形式，预先切割装订好，方便使用。
不过，卷膜肯定是最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。
不知道为什么在国外硝纤膜会被当作危险品来运输还要加收运费，所以货期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用n年——如果非要给这个n加个期限，那就是......至少可以用到等我毕业之后。
2.PVDF膜
刚开始做WB的人也许会有这种疑问：
为什么实验室的老师（或者师兄师姐们）在教我们做WB的时候，如果是用PVDF膜做，总是小心翼翼的剪，节省着用，甚至一些边边角角也舍不得丢掉呢？
其实，这不仅是因为PVDF膜比较贵，还由于PVDF膜是做WB的“杀手锏”。
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。
与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能（Pluskal,etal.,1986）。
市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！
）。
在艾滋病毒（HIV）血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被膜抗原的性能。
但是PVDF膜最大的优点不仅于此：
更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/肽分离/内部测序和免疫检测（Kurien,etal.,2003）。
特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。
所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。
此外，个人经验，一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更好一些。
PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染色都一样OK，但不适合荧光。
PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢）。
PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。
PVDF膜常见的有以下几个品牌
公司
产品名
孔径
适用范围
参考价格
Millipore
ImmobilonTransferMembranes
0.45um0.2um
$212
Bio-Rad
Immun-BlotPVDFMembrane
Chemiluminescent,colorimetricwesternblots,amino-terminalsequenceandtotalaminoacidcomposition
Pierce
PVDFMembrane
0.45um0.2um
Western,Southern,Northern,anddotblots
PallLifeScience
BioTracePVDFTransferMembrane
0.45um
Nucleicacidandproteintransfers.Proteinsequencing
$149
Invitrogen
PVDFMembrane
0.45um
0.2um
Proteinsequencing,immunoblotting
￥1625.8
Whatman
WestranClearSignalPVDFMembrane
0.45um
Westernblots
作为PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分为Immobilon-P（0.45um）,-PSQ（0.2um）,-FL（用于荧光显色）和BlottingSandwichesforHighTroughput四种。
Immobilon-P膜孔径均一，具有极强的吸附能力，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高，有助于提高检测灵敏度，而且开放的孔结构容易接近被吸附的蛋白质，并有助于去除背景上没有吸附的探针，可以说是免疫印迹检测理想的印迹膜。
Immobilon-PSQ转印膜是印迹小分子蛋白质（<20KDa）的理想选择——优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。
内表面面积较大，可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。
由于不含污染性支撑物或表面活性剂，Immobilon-PSQ层析谱上的背景峰值极小。
Immobilon-FL也是Millipore值得骄傲的产品，因为这是第一个专门为荧光显色优化的转移膜。
通过实验证明，这种膜在Kodak成像系统可以显示仅7ng的蛋白，听起来不错吧，有兴趣可以试一试。
这几种膜除了一般的PVDF膜的优点之外，最大特点就是一个字——快。
按照Millipore的操作手册，Immobilon可以在保证质量的前提下缩短WB时间到2个小时——主要是缩短封闭和洗脱时间。
这可真是个好消息，因为坐在那儿等WB结果多浪费时间啊！
缩短这个费时而枯燥的过程，早出结果，可以提高实验效率，利于我们分析实验结果，考虑下步对策嘛。
卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交，而预裁剪的即用膜更适合高通量等等“用金钱换时间”的实验。
再次强调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用MilliQ水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。
Invitrogen公司的PVDF膜也有大家风范：
膜是与两张预裁的滤纸同时提供，方便使用；虽然一般而言0.2um的膜渗漏少适用性会更强，但Invitrogen的0.45umPVDF膜自有自家优势——特别适合于低背景，高敏感度的印迹反应，同样需要在乙醇或者甲醇，或者异丙醇中浸泡5分钟就可以用了。
3.尼龙膜
尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如dotblot，比较于NC膜来说，它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高——由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出（据分子克隆III说通过热处理的酪蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮延长封闭时间可以改善），而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。
另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。
因此在许多情况下实验室人员进行WB实验不选择尼龙膜。
尽管如此，一些产品却能“取其精华，去其糟粕”，将尼龙膜一些不利于蛋白印迹的因素缩小或者去除，使其成为有效的蛋白转移介质。
比如说，化学发光底物做得相当出色的Pierce公司，其旗下的BiodyneA&BNylonTransferMembrane就是这样一个产品。
这种分为A，B两型的尼龙膜做工精良，孔径大小一致，为了保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃背景影响大的缺点，Biodyne采用了合适的signal-to-noise比例来调整，从而达到了200ug/cm2的蛋白结合能力，同时有比大多数尼龙膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。
除此之外，B型的Biodyne对于一些带负电蛋白是一种理想的转移膜，因为它在A型的基础上提高了正电荷集团的浓度。
另外Biodyne相对于NC膜来说还是一种“打不怕，撕不烂，烧不着（200℃一下）”的“顽强”的转移膜。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
A：
实际操作
1.做胶前的准备
1）检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。
2）检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳
1）装好架子。
2）按照下面配方配制分离胶。
（单位：
ml，Total：
8ml）
7.5％
10％
15%
2×Sep.buffer
4
4
4
30％Gel.sol
2.0
2.7
4
ddH2O
1.9
1.2
0
TEMED
8ul
8ul
8ul
10%APS
80ul
80ul
80ul
在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3）待分离胶凝集后，配制浓缩胶。
（单位：
ml，Total：
3.5ml）
3％
2×Stacking.buffer
1.7
30％Gel.sol
0.35
ddH2O
1.4
TEMED
5ul
10%APS
50ul
倒好后插入预先准备好的梳子。
4）待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
B：
注意事项及常遇到的问题
1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。
2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2（载荷面即：
如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：
1mm×5mm=5mm2）。
3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。
太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。
4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。
太慢不均匀，特别是甘油。
5）电泳中常出现的一些现象：
︶条带呈笑脸状，原因：
凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。
︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
拖尾：
样品溶解不好。
纹理（纵向条纹）：
样品中含有不溶性颗粒。
条带偏斜：
电极不平衡或者加样位置偏斜。
条带两边扩散：
加样量过多。
三、转移
在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜的选择：
印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。
我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。
有两种规格：
Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ（0.2umforMW<20kDa）。
A半干法
即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。
因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。
1实验条件的选择
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。
目的蛋白分子大小（kDa）
胶浓度
转移时间（h）
80---140
8%
1.5-2.0
25---80
10
1.5
15--40
12
0.75
<20
15
0.5
2实验操作
（1）滤纸和膜的准备（在电泳结束前20分钟应开始准备工作）。
A.检查是否有足够的transferbuffer，没有立即配制。
B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C.将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。
再转入transferbuffer中。
D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transferbuffer中。
（2）转移
A.在电转移仪上铺好下层滤纸。
一般用三层。
B.将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的湿润。
C.将胶剥出，去掉stackgel，小心的移到膜上。
D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。
E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。
倒上些transferbuffer，再铺两张靠胶滤纸。
F.装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。
G.转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。
靠胶滤纸
胶
膜
靠膜滤纸
3注意事项及常遇到的问题
1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。
2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。
而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。
4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。
5）转移时间一般为1.5小时，（1mA-2mA/cm2，10%gel），可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。
B湿法
我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。
C转移后效果的鉴定
1．染胶
用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。
2．染膜
有两类染液选择，可逆的和不可逆的。
可逆的有ponceau-sred、FastgreenFC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。
但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。
四、封闭（block）
封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。
常用的封闭液有bovineserumalbumin（BSA），non-fatmilk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fatmilk。
在转移结束前
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