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生化实验
实验一生物化学实验技术简介
第一节 实验误差与数据处理
一、误差
真实值与测量值之差就叫做误差，通常用准确度和精密度来评价误差的大小，测量的准确度表示测量的正确性；测量的精密度表示测量的重复性。
（一）准确度：
准确度是指测量值与真实值相接近的程度。
测量值与真实值越接近，误差越小，准确度越高。
误差可分为绝对误差和相对误差：
绝对误差＝测量值－真实值
×100％
相对误差＝
绝对误差
真实值
例如：
用分析天平称得两种蛋白质物质量为2.1750克和0.2175克，假定两者的真实值各为2.1751克和0.2176克，则称量的绝对误差分别为：
2.1750－2.1751＝0.0001（克）
0.2175－0.2176＝0.0001（克）
它们的相对误差应分别为：
×100％＝－0.005%
－0.0001
2.1751
×100％＝－0.05%
－0.0001
0.2176
由此可见，两种蛋白值称量的绝对误差虽然相等，但当用相对误差表示时，就可以看出第一份称量的准确度比第二份的准确度大10倍，因此，测量的准确度常用相对误差表示。
因为真实值是并不知道的，所以人们习惯把一个误差很小的值作为“真实值”来进行计算。
（二）精密度
精密度是一组测量值彼此符合的程度。
精密度一般用偏差来表示。
偏差是测量值与平均值之差，它分为绝对偏差和相对偏差。
绝对偏差＝测量值－算术平均值
×100％
相对偏差＝
绝对偏差
算术平均差
和误差的表示方法一样，用相对偏差来表示实验的精密度比用绝对偏差更有意义。
在实验中，对某一样品进行多次平行测定，可求得其算术平均值。
对结果的精密度有多种表示方法，这里介绍常用的两种方法。
1．平均绝对偏差和平均相对偏差表示法：
例：
五次测得某种蛋白质制剂的含氮量为：
16.1％，15.8％，16.3％，16.2％，15.6%，用平均偏差表示。
分析结果 算术平均值 绝对偏差（不计正负）
16.1％ 0.1%
15.8％ 0.2％
16.3％ 16.0％ 0.3％
16.2％ 0.2％
15.6％ 0.4％
平均绝对偏差＝
=0.2％
0.1％＋0.2％＋0.3％＋0.2％＋0.4%
5
×100%=1.25%
平均相对偏差＝
0.2%
16.0％
测定结果可用数字16.0%±0.2％表示。
2．标准差法：
例：
六次测定血清钙含量为：
9.90mg％，9.96mg％，9.94mg％，9.96mg%，9.92mg％，
9.90mg％，求标准差。
①首先求其算术平均值。
平均值＝
＝9.93mg％
9.90%＋9.94%＋9.96%＋9.92%＋9.90mg％
6
②求绝对偏差：
d1＝9.90－9.93＝－0.03
d2＝9.96－9.93＝＋0.03
d3＝9.94－9.93＝＋0.01
d4＝9.96－9.93＝＋0.03
d5＝9.92－9.93＝－0.01
d6＝9.90—9.93＝－0.03
⑧求出标准差（S.D）
S.D＝±
∑d2
n－1
n为测定次数。
结果表示用“平均值±标准差”：
（9.93±0.03）mg％。
应该指出，误差和偏差具有不同的含义。
误差以真实值为标准；而偏差以平均值为标准，用平均值代替真值来计算误差，得到的结果是偏差，
还应该指出，用精密度来评价分析的结果是有一定的局限性的。
分析结果的精密度很高（即平均相对偏差很小）并不一定说明实验准确度也很高。
如果分析过程中存在有系统误差，可能并不影响每次测得数值之间的重合程度，即不影响精密度。
但此分析结果却必然偏离真实值，也就是分析的准确度并不一定很高，当然，若是精密度也不高，则无准确度可言。
二、产生误差的原因和校正
直接测量误差主要由下面三种原因产生：
1．测量方法本身的优劣；
2．测量仪器的精度；
3．测量者本人的习惯及熟练程度。
根据以上原因，可按误差性质和来源分为三类。
（一）系统误差
也叫可定误差，是由确定原因引起，服从一定函数规律的误差，一般有一定的方向，即测量值总是比真值大或比真值小。
常反复出现，多数情况可由对分析方法有透彻理解的人发现而清除。
这种误差多因测量方法错误、仪器或试剂不合格、操作不正规等原因造成。
为减少系统误差常采取下列措施：
1．空白试验：
在不加样品情况下，而按与样品测定完全相同的操作和完全相同的条件下进行分析，得到空白值。
将样品分析的结果扣除空白值，可以得到比较准确的结果。
2．回收率测定：
取一定量标准物质，添加到待测的未知样品中，与待测的未知样品同时做平行测定。
×100%
测定值＝
实际测定值
理论值
一般的分析方法，要求回收率在95~105％之间。
系统误差越大，回收率越低。
3．仪器校正：
对测定仪器进行校正，以减少误差。
4．操作正规，提高实验技巧。
（二）偶然误差
是由不确定原因引起，服从统计规律、具有抵偿性的误差，为了减少偶然误差，一般
采取的措施是：
1．平均取样：
动植物新鲜组织可制成匀浆后取样；
2．多次取样：
进行多次平行测定，然后取算术平均值，就可以减少偶然误差。
（三）过失误差
测量时犯了过失或测量条件突变而产生的误差。
如读错刻度，溶液溅出，加错试剂等。
在进行数据处理时应将此种数字除去不用。
三、有效数字
有效数字应是实际可能测定到的数字，它包括“可靠数字”和最后一位“欠佳数字”。
记录数据时应选取几位有效数字，取决于实验方法与所用仪器的精确程度而定，特别是现在由于电子计算机的使用，往往不注意有效数字，而随意记录所用仪器不可能达到的精确数字，因此更强调有效数字的必要。
例如：
用分析天平称得某物为1.1415克，是有五位有效数字，而用台秤称得该物为1.14克，则只有三位有效数字。
又如：
读取某刻度吸管为1.00毫升，是三位有效数字；读取0.54毫升，是二位有效数字。
又如：
六位有效数字 111.004 1.26014 12.5000
五位有效数字 2189.0 12.001 1.2000
四位有效数字 21.00 3.561 732.5
三位有效数字 23.0 100±1 2.30×103
二位有效数字 0.0010 1.5 1.2×105
有效数字不明确200105000
（一）有效数字的运算：
1．加减法：
多个测量值相加减时，结果的有效数字应以各测量值最大欠准数字为准。
如：
13.72
1.534
＋0.3005
15.55
2．乘除法：
多个测量值相乘除时，结果的有效数字应与有效数字位最少的那个测量值相同。
＝4.3
如：
0.1545×3.1
0.112
还应指出，有效数字位数最少的那个数，首位是8或9时，而其结果的首位不是8或9时，应多保留一位。
如：
0.9×1.2×36.1＝39.99
0.9×9＝8.1
若一个数值没有欠准数字，便可认为是无限有效。
例如将7.12克样品二等分；每分重量为：
=3.56（克）
7.12
2
式中除数2不是测量所得，因此可认为是无限有效数字。
（二）有效数字的修约：
按“四舍六入五成双”规则进行修约，如：
1． 14.2432 → 14.2
2． 26.4843 → 26.5
3． 1.0501 → 1.0
4． 0.15 → 0.2
5．不得连续修约：
15.4546≠16 应为15.4546 → 15
（三）有效数字运算步骤：
1．把各数修约到比最后结果的位数多一位。
例如，13.65＋0.00823＋1.633，其中13.65小数点后只有两位，所以要把0.00823修约成0.008，1.633不变。
又如，0.0121×26.64×1.05782，其中0.0121为三位有效数字，故把1.05782修约成1.058，26.64不变。
2．进行加、减、乘、除运算，
13.65
0.008 25.64 0.310
＋1.633 ×0.012 ×1.050
15.291 0.31024 0.32798
3．最后对计算结果进行修约。
15.291→15.29
0.32798→0.328
四、数据处理：
对实验中所得到的一系列数据，应进行适当的分析、整理，才能反应出被研究对象的数量关系。
在生化实验中，通常采用列表法或作图法来表示实验结果，以使结果表达得清楚、明了。
1．列表法
将实验所得各数值用适当的表格列出，并表示出它们之间的关系。
通常数据的名称和单位写在标题栏中，表内只填写数字，数字应正确反映测定的有效数字，必要时应计算出误差值。
例如：
血清总蛋白测定时各管所加的试剂及测定的结果
总蛋白
标准液
空白
管别
试剂（m1）
血清 － － 0.10
蛋白标准液 － 1.0 －
0.9％NaCl 2.00 1.00 1.90
双缩脲试剂 3.00 3.00 3.00
光密度 － 0.400 0.450
血清总蛋白（克％） － － 6.75
2．作图法：
实验所得到的一系列数据之间的关系及其变化情况，可以用图线直观地表现出来。
作图时通常先在坐标纸上确定坐标轴，标明轴的名称和单位，然后将各数值用“O”或“×”等符号标记在坐标纸上，再用直线或曲线把各点连接起来。
图形必须是平滑的曲线或直线，可以不通过所有的点，但要求线两旁偏离的点分布较均匀。
在画线时，个别偏离过大的点应当舍去，或多次重复实验校正之，采用作图法时至少有五个以上的点，
否则便没有意义。
第二节 光度法的原理与分光光度计的使用
（Principlesofphotometryandtheuseofphotometers）
生物化学定性、定量的研究中，运用最广泛的是比色法测定，比色法属吸收光谱分析，即用一束光通过待测物溶液，获得入射光强度与透过光强度的变化率，借此来对待测物进行定性、定量分析。
比色法从最初的可见光区推广到紫外光区，红外光区，从用一定波长范围的光推广到单一波长的光，运用范围日益广泛，灵敏度、准确性日渐提高，现在，各种光电比色计，分光光度计已成为实验室必备的仪器。
一、原理
（一）吸收测量的可能
光波是一种电磁波，每一定波长的光均具有一定的光能量，光的波长越短，所具有的光能量越大，人们按其肉眼所能否感知将光分为可见光（波长范围400~750nm），紫外线（波长小于400），红外线（波长大于750nm）如下表所示。
光 波 长 与 区 带
光 波 波 长（λ）
－10－6（cm） 100A
紫外线 真空 －10－5 100A
紫外 －2×10－5 200A
近紫外 －4×10－5 400A
可见光线 紫 4200A
蓝 4900A
绿 5300A
黄 5900A
橙 6500A
红 7500A
红外线 近红外 －l0－4 1μ
中红外 －10－3 10μ
远红外 －10－2 100μ
物质的基本组成单位是分子，分子由原子组成，原子又由原子核及核外电子组成，整个分子及核外电子均处于一定的能级状态，核外电子或整个分子可以吸收一定的光能量，发生跃迁或转动、振动。
各种物质由于所组成的核外电子不同，只能吸收一定的光能量，换言之，只能吸收一定波长的光。
一定波长的光具有一定的光能量，一定物质只能吸收一定的光能量，表现为对一定波长的光选择性吸收，这就给吸收光谱测量带来可能。
（二）Lambert－Beer定律
早在一、二十世纪前，人们就发现：
当光通过某一溶质的溶液时，光的强度变化与溶液的浓度和液层的厚度存在着一定的关系。
1927年，Lambert指出：
一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收的光能量与溶液介质厚度有一定的比例关系。
＝adL…………………………………
（1）
即：
dL
I
上式两边积分：
＝
－adL
∫
∫
I dI1
I0 I0
＝－aL
In
得：
I
I0
＝al…………………………………
（2）
ln
故：
I0
I
式中：
I0 为入射光强度
I 为透过光强度
1 为溶液介质的厚度
a 为熔液介质的吸收系数
将
（2）式换成常用对数：
即
·0.4343＝0.4343·a·1
ln
I0
I
=0.4343·al
lg
lg
I0
I
令 K＝0.4343a
=Kl …………（3）
Ig
得：
I0
I
（3）式为Lambert定律的数学表达式
1852年，Beer作了类似实验，指出光强度变化与溶液中溶液浓度也存在类似关系：
＝Kc…………………………………（4）
Ig
即：
I0
I
式中的c为溶液介质的浓度。
（4）式为Beer定律的数学表达式
将（3）（4）合并
＝KCL………………………………（5）
得：
I'0
I
T＝
A＝
令：
I0 I0
I I
则 A＝KCL…………………………………（6）
A＝－lgT………………………………（7）
（6）式为Lambert－Beer定律的物理表达式，其含义为：
一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。
Lambert－Beer定律是整个比色测定的理论基础。
（三）比色测定的局限性：
1．只有单色光辐射吸收，才严格遵循Beer定律。
所谓单色光。
即指单一波长的光。
如果用杂光源照射，吸收度与浓度不成直线关系。
基于此，现代分光光度计在提高光的单色性上做了大量工作，仅管如此。
要获得十分单一的光辐射是相当困难的。
故在实际测量时，常需做所测物溶液的光吸收曲线，选择既灵敏吸光度又随波长相对变化不大的区域为测定时波长。
如图：
选择Ⅰ区显然较Ⅱ区优良。
2．仅适用于稀释溶液
在高浓度溶液里，粒子间相互影响增大，可改变吸光能力，使吸光度与浓度不成直线关系。
3．混合物溶液可能相互干扰多种物质共存，其光吸收可能相互干扰，因此，必须尽可能除去可能引起干扰的物质。
4．吸光反应控制在一定的范围
实验证明，比色测定时，A＝0.368时测定值与真实值的误差最小，故一般应控制A在0.2~0.8范围内，过低或过高测定误差均大大增加，实际测量时，多控制A在0.1~0.65之间测定。
以上是以Lambert－Beer定律为基础的比色测定的局限性，亦为实际测定时应注意之处。
二、仪器及使用：
光源
吸收光谱测定的常用仪器常分为两大类，光电比色计与分光光度计，二者均有如下基本结构：
样品
检测系统
指示器
光信号转
换装置
信号放
大装置
比色杯
样品室
单色器
辐射源
实验室常用光电比色计与分光光度计各结构如下表
光电信号
转换装置
辐射源 单色器 比色杯 信号放大装置 指示器
581－G型比色计
6.3V钨灯滤色片 玻璃杯 光电池 检流计
72型分光光度计
5.5V或10V钨灯
棱镜分光玻璃杯 光电池 检流计
721型分光光度计
12V钨灯棱镜分光玻璃杯 光电管 微电流放大器 检流计
751型紫外 6V钨灯 石 英 玻璃杯红敏光电管微电流放大器检流计
分光光度计 氢弧灯棱镜分光 石英杯兰敏光电管
751型分光光度计将比色法推广到紫外区，可对无色物质进行“比色”测定，在紫外区，一切玻璃元件均采用石英元件，以防止玻璃对紫外线的吸收。
以上四种型号的仪器使用中均有共同步骤：
一、开稳压电源；二、预热；三、调仪器零点；四、调空白零点；五、测定。
以下分述之：
1．581－G型光电比色计：
结构模式图：
光 透 滤 比 光 检
源 镜 光 色 电 流
片 皿 池计
操作：
将光电比色计置于背光而平稳的台面上，按规定接上电源，拨开关使其指向“1”，预热10分钟，旋转零点调节器，使读数盘上亮圈中的黑线位于透光度“0”或光密度“∝”处。
然后选择适当滤光片插入滤光片插座中。
取清洁比色皿（只能拿毛玻璃面）分别盛装空白，对照及测定液约3/4容积，皿之外面如有水珠，必须用软绸布或擦镜纸擦干，分别盛装入比色槽中，以免污染或损坏比色计。
将空白或对照皿置于光路上，再将开关拨向“2”位置，依次利用粗调节及细调节改变电阻，使读数盘上亮圈中的黑线恰好于透光度“l00”或光密度“0”处，移动比色槽使测定皿置于比色位置，读数盘上亮圈发生移动，等光圈移动停止后，立即读记亮圈黑线所指的光密度数。
再重复二次，以求准确。
读数结束后，换置另一测定液置于光路上按上述方法继续读取光密度，如需取出比色皿时，应先将开关拨回到“1”后再进行。
使用结束后，将开关拔到“0”，拔去电源，取出比色皿，及时清洗，放置晾干，切忌用毛刷刷洗，以免损坏玻璃的透光性。
2．72型分光光度计
72型分光光度计由三大件组成：
磁饱和稳压电源，单色器及波长盘、检流计。
结构如图：
1光源 2透镜 3光学棱镜 4光学平面镜 5透镜 6狭缝
7比色皿 8硒光电池 9检流计 10透镜 11检流计光源 12读数盘
操作方法：
使用时先将单色光器分别与电磁稳压器及检流计连接好，然后将电磁稳压器及电流计之电源分别与电压适合之交流电相接，依次打开三大部件电源开关，使全部仪器通电，预热10分钟。
将空白或对照液及测定液分别装入比色皿内，并将比色皿外壁擦干置于比色盒中，通常将空白液置于近端第一位，测定液置于前面二个位置，将比色盒再放入比色箱中，检查是否稳妥，随即盖好箱盖。
将单色光器波长盘调至所需波长，再调节电流计上零点调节器，使读数盘上指针所指的光密度为“∝”或透光度为“0”。
打开单色光器上的光径开关，使光线射入，然后用光量调节器改变狭缝的宽度，使检流计上的指针移动到光密度“0”或透光度“100％”。
待检流计指针稳定时，逐步拉出比色槽滑杆，同时读取检流计上光密度。
读数完毕，立即关闭光径通路开关，再取出比色盒，将比色皿冲洗干净。
3．721型分光光度计：
结构示意图：
l光源 2透镜聚光 3色散棱镜 4准直镜 5保护玻璃 6狭缝
7反射镜 8光栏 9聚光透镜 10比色皿 11,12光门 13光电管
使用方法：
使用前先检查电源与仪器所要求的电压是否相等，然后接通电源，打开比色皿暗盒盖，使电表指针处于“0”位，预热20分钟后，用波长调节器选用所需要的单色光波长，和相应的放大灵敏度档，用调“0”电位器校正电表“0”位。
将空白溶液的比色皿放在比色架的第一格，其余三格放待测溶液比色皿，将比色皿暗盒盖盖上，这时空白溶液在光路上，光电管见光，旋转光量调节器，使电表指针正确地指在100％透光率上。
按上述方法连续几次调整“0”位和电表指针100％，仪器即可进行测定工作。
拉动比色架固定拉杆，使第二个比色皿溶液处在光路中，读取电表指针所指的光密度放大器灵敏度档的选择是根据不同的单色波长，光能量分别选用，灵敏度范围是第一档，1倍；第二档，10倍；第三档，20倍。
原则是使空白溶液良好地用光量调节器调整于100％透光率。
3．751型分光光度计：
结构如图：
光 源：
1钨丝灯 2凹面镜 3氢弧灯
单色器：
4平面镜 5石英窗 6弯曲狭缝 7准直镜 8石英棱镜 9石英透镜
测试室：
10滤光片架 11试样槽 12试样槽拉杆
接受部分：
13暗电流控制闸门 14紫敏光电管 15红敏光电管16光电管滑动架 17接放大器
使用方法：
1．打开仪器电源预热20分钟左右，使仪器稳定工作。
2．选择相应于波长的光源灯，比色皿和光电管。
钨灯适用于波长320~1000nm范围，氢灯适用于200~320nm范围，对350nm以上的波长用玻璃比色皿，对350nm以下的波长用石英比色皿，手柄推入为紫敏光电管用于200~625nm波长，手柄拉出为红敏光电管，用于625~1000nm波长。
3．灵敏度旋钮从左面“停止”位置顺时针方向旋转3圈左右。
4．将选择开关扳到“校正”处。
5．调节波长刻度到所需的波长。
6．调节暗电流使电表指针到“0”，为了得到较高的准确度，每测量一次，暗电流分别校正一次。
7．将空白溶液放在比色皿架的第一格，其它放待测溶液，盖上暗盒，使空白溶液对准光路。
8．将读数电位计调至透光率100％（即光密度为0）。
9．将选择开关扳到“Ⅺ”，拉开暗电流闸门，使单色光进入光电管。
10．调节狭缝，大致使电表指针到“0”位，然后用灵敏度旋钮细调，使指针正确地指在“0”位。
11．轻轻拉动比色皿架拉杆，使待测溶液进入光路，此时电表指针偏离“0”位。
12．旋转读数电位计，使电表指针重新指到“0”位，读取待测溶液的光密度值。
在指针平衡后，要将暗电流闸门重新关上，以便保护光电管，勿使受光太长而疲劳。
13．当选择开关放在“×1”时，透光率从0~100％，消光度从∝~0。
当透光率小于10％时。
可选用“×0.1”的选择开关，使获得较精确的数值，此时读出的透光率数值要“×0.1”，或相应的光密度值要加上1。
三、计算：
（一）利用标准管计算测定物含量：
实际测定过程中，用一己知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读取光密度，再根据（6）式计算。
A1＝K1C1L1
A2＝K2C2L2
式中A1、A2分别为已知浓度标准管和未知浓度测定管光密度。
C1、C2分别为已知浓度标准管和未知浓度测定管测定物浓度。
因盛标准液和测定液的比色皿内径相同（L1＝L2）故上二式可写成：
…………………
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