紫红线茄转基因体系的优化及基因SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化.docx

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紫红线茄转基因体系的优化及基因SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化

园艺学报2014，41（6）：

1105–1114http:

//www.ahs.ac.cn

ActaHorticulturaeSinicaE-mail:

yuanyixuebao@

收稿日期：

2014–02–13；修回日期：

2014–05–06

基金项目：

浙江省新品种选育重大科技专项（2012C12903）；浙江省农业科学院创新提升工程项目（2012R23Y01E01）

*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：

maowh@）

紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA

干涉表达载体的遗传转化

包崇来，杜黎明，胡天华，朱琴妹，胡海娇，毛伟海*

（浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州310021）

摘要：

建立了以紫红线茄下胚轴为外植体的高效转基因体系。

利用该方法，以获得茄子SmARF8

基因RNA干涉转基因植株为目的，构建了以NPTⅡ基因为筛选标记的融合表达载体pCAMBIAI

35S-2300-SmARF8-INT，并通过农杆菌介导，侵染茄子下胚轴外植体。

含有2mg·L-1吲哚乙酸，0.5mg·L-1

玉米素，25mg·L-1卡那霉素和500mg·L-1头孢氨苄的MS选择培养基可直接诱导外植体产生转基因分

化苗，再生率达到80%。

转基因苗继续生长并在不含激素的MS培养基上产生健壮根系，最终获得转基

因株系。

RT-PCR和qRT-PCR分析验证了T0代转基因株系中内源基因SmARF8被干涉后不表达或表达量

降低，Southernblot分析显示选择的T0代转基因株系中存在1个T-DNA插入拷贝。

以上研究结果表明利

用建立的转基因体系SmARF8基因在茄子中被成功敲除。

关键词：

茄子；转基因；RNA干涉；农杆菌

中图分类号：

S641.1文献标志码：

A文章编号：

0513-353X（2014）06-1105-10

OptimizationoftheTransgenicSystemandGeneticTransformationof

SmARF8GeneRNAiVectorinRed-purpleLongEggplant

BAOChong-lai，DULi-ming，HUTian-hua，ZHUQin-mei，HUHai-jiao，andMAOWei-hai*

（TheInstituteofVegetable，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China）

Abstract：

Ahighefficientgenetictransformationsystemwasdevelopedusinghypocotylexplantsfor

producingtransgenicred-purplelongeggplant（SolanummelongenaL.）.TogenerateSmARF8geneRNAi

transgeniceggplantplants，thebinaryvectorpCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INTwiththeselectable

markergeneneomycinphosphotransferase（NPTⅡ）wasconstructedandtransformedintoeggplant

hypocotylexplantsviaAgrobacteriumtumefaciens-mediatedinfection.Transgenicplantletswereinduced

onMSselectivemediacontaining2mg·L-1indole-3-aceticacid，0.5mg·L-1zeatin，25mg·L-1kanamycin

and500mg·L-1cefotaximewithregenerationratiohigherto80%.Subsequently，thetransgenicplantlets

keptgrowingonsamemediumandthenrootedefficientlyonMSbasicmediatobecometransgenicplants.

TheRT-PCRandqRT-PCRanalysisshowednoorlesstranscriptofSmARF8inT0transgenicgeneration.

FurtherSouthernblotanalysisofselectedT0transgenicplantsconfirmedthepresenceofsingleT-DNA

insertion.TheseresultsdemonstratethattheendogenesisSmARF8hasbeensuccessfullyknockedoutin

1106园艺学报41卷

eggplantusingtheestablishedtransgenicsysteminthisstudy.

Keywords：

eggplant；genetictransformation；RNAinterference；Agrobacteriumtumefaciens

茄子（SolanummelongenaL.）极易受黄萎病和青枯病等多种病害以及各种昆虫的危害，虽然部

分野生种拥有天然抗性，但因连锁有害基因的存在，导致育性不兼容（Pratapetal.，2011）。

随着分

子生物学和基因工程的研究进展，可将各种重要调控基因转导到茄子中，快速改良品种（Mariashibu

etal.，2012）。

如Rotino等（1997）采用基因工程手段，利用生长素合成基因，获得单性结实茄子

品种，并在番茄、草莓、悬钩子、葡萄上进行了推广应用（Rotinoetal.，1997，2005；Ficcadentiet

al.，1999；Mezzettietal.，2004）。

目前茄子转基因已得到广泛研究。

如以根为外植体，0.1mg·L-1TDZ和3mg·L-16-BA能通过

愈伤组织诱导产生不定芽，但是该方法耗时较长（Franklin&Lakshmi，2003）；以子叶为外植体，

2.5mg·L-16-BA和0.5mg·L-1IAA能直接快速诱导产生再生苗，再生率达到60%（Prabhavathietal.，

2002）；Singh等（2010）以茎段为外植体，pPRV111A质体表达载体经基因枪轰击，成功获得转基

因茄子；Subramanyam等（2013）以茄子种子为外植体，利用乙酰丁香酮和SilwettL-77的辅助侵

染，真空导入pCAMBIA1301-bar载体获得转基因苗。

Singh等（2010）和Subramanyam等（2013）

创建的转基因方法，能大幅度缩短转导时间，且为茄子基因工程提供了新思路，但是需要配备特定

的操作仪器，成本较高。

虽然已有多种方法成功获得茄子转基因苗，但不同基因型材料的再生能力

差异很大，影响再生的途径（金丹丹等，2004），如对浙江省大面积种植的紫红线茄采用已公开发

表的转基因方法，均不能成功获得转基因植株。

许多试验表明选择标记基因和GUS报告基因的启动子会影响临近启动子的表达能力和特异性

（Yooetal.，2005；Zhengetal.，2007）。

目前已有许多研究人员意识到这种反馈抑制，并开展了关

于如何增强多启动子调控的机制研究，期望能避免或者阻止这种不良影响（Singeretal.，2011）。

且

GUS报告基因和选择标记基因的存在不利于转基因植株在育种上的直接应用，消费者由于担心标记

基因的副作用而不能完全接受。

Darwish等（2014）利用pMAT21载体，以子叶为外植体，获得无

抗性标记基因的转基因苗，可在育种中直接得到应用。

本试验中以紫红线茄为材料，针对其转基因过程中植物生长调节剂种类和浓度、选择压卡那霉

素浓度进行了改良，创建了不含GUS报告基因的融合表达载体，期望能建立一个最有效、最适宜紫

红线茄的转基因体系，为加速茄子育种建立理论基础。

1材料与方法

1.1材料及其处理

选择浙江省大面积种植的紫红线茄品种亲本‘E666’、‘E25’、‘E22’和‘E673’等4个材料进

行转基因体系创建工作。

精选种子经75%乙醇处理30s后，用10%NaClO表面消毒15min，或0.1%HgCl2分别消毒1min，

2min，无菌水洗涤5次。

平铺到含3%蔗糖和200mg·L-1头孢氨苄（Cefotaxime，Cef）的MS固体

培养基上，以不加Cef为对照。

每瓶放置20粒种子，3次重复。

在（30±1）℃，黑暗中培养7d

后开始发芽，在光照300µmol·m-2·s-1、28℃/20℃（16h/8h）的生长箱内继续培养7d，培育出

含有2片子叶的无菌小苗。

6期包崇来等：

紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化1107

1.2载体构建

根据茄子生长素响应因子SmARF8基因（FJ597628）cDNA序列设计引物SmARF8-INT-F和

SmARF8-INT-R（表1）（杜黎明等，2009），以茄子叶片cDNA为模板，进行PCR扩增。

条件为：

94℃变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，运行32次循环。

PCR产物用1.2%琼脂糖

凝胶电泳进行检测（图1）。

2个PCR扩增片段分别以3′→5′和5′→3′方向构建到PBS-in载体玉米

NIR1基因第2个内含子350bp片段两端后，用SacⅠ和PstⅠ进行双酶切，获得含有内含子结构及

2个PCR片段的部分，命名为片段A。

将CaMV35S启动子亚克隆到pCAMBIA1300载体（http：

//

www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors.html）的EcoRⅠ和SacⅠ酶切位点之间，豌豆Rubisco

E9基因的poly（A）序列插入到载体PstⅠ和HindⅢ酶切位点之间，成功获得pCAMBIAI35S-1300

载体。

酶切后的片段A，用T4DNA连接酶构建到SacⅠ和PstⅠ酶切后的pCAMBIAI35S-1300载

体上；将含有35S启动子、片段A和poly（A）终止子的载体pCAMBIAI35S-1300-SmARF8-INT经

EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，构建到经EcoRⅠ和HindⅢ酶切的pCAMBIAI35S-2300载体上，成为

含有NPTⅡ抗性基因的复合表达载体pCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT。

以SmARF8-INT-F和

SmARF8-INT-R引物对构建好的载体进行测序验证（上海生工生物工程公司），EcoRⅠ和HindⅢ进

行酶切鉴定。

表1引物序列

Table1Primersequences

名称

Name

序列（5′–3′）

Sequence（5′–3′）

目的基因

Gene

SmARF8-INT-FCAGTTTCAACATCAACAGCGAACCSmARF8

SmARF8-INT-RACAAATGGAGTAACCCGAGAAG

SmARF8-Q-FTTCCCAGCAAACCTTTTCTGATATG

SmARF8-Q-RCGCTTTGATGATGAGGACGAAGAC

SmActin-FGCTAGTGGTCGTACAACTGSmActin

SmActin-RCAGCAGTGGTGGTGAACATATAAC

NPTII-FGAGGCTATTCGGCTATGACTGNPTII

NPTII-RATCGGGAGGGGCGATACCGTA

1.3预培养

分化培养基选择附加不同浓度吲哚乙酸（Indole-3-aceticacid，IAA）和玉米素（Zeatin，ZT）

的MS培养基（表2）。

在超净台下将无菌苗的下胚轴切成0.5cm长的片段，切下带柄子叶，分别接

种到各种浓度培养基上。

25℃，16h光照/8h黑暗，50µmol·m-2·s-1光照强度的生长室内预培养

生长2d。

1.4农杆菌侵染和共培养

将融合表达载体pCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT经电击转化转入农杆菌EH105菌株中，挑

取单菌落，在含有50mg·L-1卡那霉素（Kanamycin，Kan）和链霉素的5mLYEP液体培养基中28

℃震荡培养过夜，再倒入50mLYEP继续培养5h，直到OD值为0.4~0.7。

菌液700×g离心5min

后，去除上清液，沉淀用等体积MS液体培养基重新悬浮。

无菌外植体预培养2d后，在农杆菌悬

浮液中浸润5min，在无菌滤纸上沥干，然后重置回预培养瓶中继续培养2d。

1.5分化与生根培养

农杆菌侵染后，外植体在预培养基上共培养2d后，转移到分别添加有100、50、25mg·L-1Kan

1108园艺学报41卷

和500mg·L-1Cef的MS选择培养基上（植物生长调节剂浓度同预培养基）继续生长，直到获得不

定芽，统计出芽率（长出不定芽的外植体占总数的百分比）。

分化苗延伸生长后转移到不含植物生长

调节剂的MS选择培养基上进行生根培养。

生根后转移到含有营养土的塑料钵中，在温室中进行生

长，直至开花结果，收集种子。

1.6转基因茄子的RT-PCR和qRT-PCR分析验证

为了检测转基因苗的基因干涉效果，用半定量RT-PCR分析检测SmARF8基因的转录表达情况。

利用RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），将转基因及对照非转基因苗的叶片组织，提取总

RNA后，用SuperScriptTranscriptaseⅢ（上海生工生物工程公司）逆转录成第一链cDNA。

以干涉

载体构建引物SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R（表1）进行PCR检测，以茄子SmActin为参考基

因，设计引物SmActin-F和SmActin-R（表1）。

PCR扩增条件为：

94℃变性2min；94℃30s，60℃

30s，72℃30s，运行28次循环。

PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

根据SmARF8基因序列设计引物SmARF8-Q-F和SmARF8-Q-R（表1），进行荧光实时定量

qRT-PCR分析验证。

同样以SmActin为参考基因。

根据RealMasterMix（SYBRGreen）试剂盒（天

根生化科技有限公司），ABIPrismSTEP-ONEPLUSreal-timethermalcycler仪器（Applied

Biosystems，Carlsbad，CA，USA）进行qRT-PCR分析。

94℃变性10min；94℃20s，60℃60s，

运行40次循环，同时进行溶解曲线分析，确保PCR产物唯一性。

3次重复。

1.7转基因茄子Southernblot分析验证

为了进行Southernblot分析转基因植株的拷贝数，根据CTAB法以及改良的茄子DNA提取体

系（杜黎明等，2007），分别从转基因与非转基因植株新鲜叶片中提取基因组DNA。

10µgDNA通

过限制性内切酶EcoRⅠ酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳后转移到Hybond尼龙膜上。

根据载体上的抗性

基因NPTⅡ序列设计引物NPTⅡ-F和NPTⅡ-R（表1），获得700bpPCR片段为探针，α-[32P]（New

EnglandBiolabs）进行同位素标记，根据Sambrook等（1989）的方法进行杂交。

室温下将膜分别用

2×SSC+0.1%SDS和1×SSC+0.2%SDS冲洗，65℃下分别在0.5×SSC+0.1%SDS和0.1×SSC+

0.1%SDS中漂洗30min，晾干后分析。

2结果与分析

2.1消毒方法的确立

0.1%HgCl2处理的种子，播种在不含Cef的MS固体培养基上生长发芽结果显示，处理2min

的种子不会污染，但是发芽率只有10%；而处理1min的种子污染率为50%，发芽率也只有50%。

因此，HgCl2消毒方式不适合茄子无菌苗的培养。

10%NaClO消毒15min的种子，播种在不含Cef的MS固体培养基上，污染率为30%，但是发

芽率达到80%~90%。

MS固体培养基中加入200mg·L-1Cef后，不会出现污染，发芽率也没有受

影响，能达到90%左右。

因此最后选择10%NaClO消毒15min，在含200mg·L-1Cef的MS固体

培养基上培养无菌苗。

2.2融合表达载体pCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT的构建

以SmARF8-INT为引物的PCR克隆扩增获得294bp片段，产物位于SmARF8基因1609~1902

bp区段。

首先将PCR扩增片段构建到含有内含子结构的PBS-in载体上，以至于当这个片段转导到

6期包崇来等：

紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化1109

植物体内时能形成发夹结构，从而达到干涉内源基因，使它们不能进行转录表达的目的。

为了构建不含GUS报告基因的转导载体，选择pCAMBIAI35S-2300载体，但是该载体不含有

可以利用的35S–启动子—终止子序列。

所以首先将可以形成发夹结构的片段A构建到含有35S–

启动子—终止子的pCAMBIAI35S-1300载体上，产生35S–启动子—片段A—终止子的完整结构，

再将该部分酶切连接到pCAMBIAI35S-2300载体上，从而获得融合表达载体pCAMBIAI35S-

2300-SmARF8-INT（图1）。

EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定结果显示有约2500bp的条带从载体上切除下来，表示载体构建成

功（图2），并经测序进一步验证了插入片段序列。

图1载体构建过程框架图

A：

含有玉米NIR1基因第2个内含子的PBS-in载体，SmARF8基因片段分别以相反方向构建到内含子区域两端，被命名为片段A；

B：

PCAMBIAI35S-1300-SmARF8-INT载体T-DNA区域；C：

PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT载体T-DNA区域。

Fig.1Schematicrepresentationofthevector

A：

ThePBS-invectorwithNo.2intronsofmaizeNIR1，inwhichtheSmARF8PCRfragmentsarelocatedintwosidesofintronsasreverse

directionandthefragmentwasnamedA；B：

TheT-DNAregionofPCAMBIAI35S-1300-SmARF8-INTvector；

C：

TheT-DNAregionofPCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INTvector.

图2PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT载体EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定

2500bp条带为酶切后的插入片段。

Fig.2ThevectorPCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INTwasdigestedbyEcoRⅠandHindⅢ

The2500bpbandistheinsertfragment.

1110园艺学报41卷

2.3选择培养基条件筛选及转基因苗的产生

融合表达载体pCAMBIA35S-2300-SmARF8-INT带有Kan报告基因，因此选择培养基中须加入

合适浓度的Kan，并加入Cef抗生素以抑制农杆菌。

紫红线茄材料‘E666’无菌苗的下胚轴和带柄子叶外植体经农杆菌侵染后转移到含不同浓度ZT，

IAA，25、50和100mg·L-1Kan及500mg·L-1Cef的选择培养基上生长，结果发现当Kan浓度为

100和50mg·L-1时，外植体生长7d后就会开始褐化直到死亡；当Kan浓度降低到25mg·L-1时，

外植体生长良好，因此表明25mg·L-1Kan浓度为较合适选择压。

在不同浓度ZT、IAA组合和25mg·L-1Kan及500mg·L-1Cef的选择培养基（表2）上，‘E666’

无菌苗的下胚轴外植体生长情况有所区别，在8号培养基上生长情况最佳，大部分下胚轴能未经愈

伤组织分化而直接长出不定芽，出芽率达到80%（图3，A、B；表2）；7号和9号培养基出芽率分

别为32%和33.3%；其他的都低于30%，甚至为0。

带柄子叶外植体在各选择培养基上均没有长出

不定芽，且在培养基上生长7d后开始呈现褐化，最后死亡。

其他3种材料‘E25’、‘E22’和‘E673’的培养结果与‘E666’相似，下胚轴外植体能在8

号培养基上诱导产生不定芽，出芽率为60%~80%，而带柄子叶外植体都在选择培养基上褐化直至

死亡。

终上所述，紫红线茄下胚轴外植体，较适宜的选择培养基为2.0mg·L-1ZT+0.5mg·L-1IAA+25

mg·L-1Kan+500mg·L-1Cef的MS培养基，可以作为其转基因体系。

利用该优化转基因体系，一共获得80株分化苗。

分化苗长到适宜大小后，尽量切除干净外植

体，转移到玻璃瓶中，在同样的MS选择培养基上继续延伸生长。

28d后，转基因苗在不加任何激

素，含25mg·L-1Kan和500mg·L-1Cef的MS培养基上进行生根培养，能产生健壮根系，成功获

得完整植株。

最后将50株有完整根系且发育良好的植株转移到含有营养土的塑料钵中，在玻璃温室

中继续生长（图3，C~F），以便收集种子。

表2分化培养基中玉米素和吲哚乙酸的浓度配比及分化效率

Table2TheconcentrationofZTandIAAondifferentialmediumandtheefficiencyofbudsinduction

名称

Code

ZT/

（mg·L-1）

IAA/

（mg·L-1）

出芽的下胚