基因工程论述及解答题.docx

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基因工程论述及解答题

1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。

答：

限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号.基本原则:

3-4个字母组成,方式是:

属名+种名+株名+序号;首字母:

取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母:

取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母:

（1）取种名的第二个字母,斜体小写;

（2）若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母:

若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体.顺序号:

若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.

2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？

受哪些因素影向？

答：

Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。

条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。

概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：

（1）高甘油含量（>5％,v／v）；

（2）限制性内切核酸酶用量过高（>100U／ugDNA）；

（3）低离子强度（<25mmol／L）；

（4）高pH（8.0以上）；（5）含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；

（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等）。

3、影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？

答：

（1）DNA的纯度

（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）核酸内切限制酶的缓冲液

4、什么是Klenow酶？

有哪些活性？

在基因工程中有什么作用？

答：

Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。

由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。

Klenow酶主要有下列用途：

（1）修复反应，制备平末端

可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。

如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。

用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。

用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。

（2）标记DNA3'突出末端（protrudingend）

该反应分两步进行：

先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物（-32p-dNTP）存在下，使降解（3'-5'）作用与聚合（5'-3'）作用达到平衡。

这种反应也叫交换或取代反应（exchange／replacementreaction）。

不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。

（3）其他的一些用途：

包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法（primerextension）制备单链DNA探针等。

5、细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？

在基因工程中有什么用途？

答：

主要差别是：

CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。

应用：

（1）dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。

但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，再进行连接反应。

（2）DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。

1、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?

答：

可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。

或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。

1、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？

为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？

答：

YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。

YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。

大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

2、列举质粒载体必须具备的4个基本特性。

答：

（1）独立复制；

（2）有选择标记；（3）有独特的酶切位点；（4）能转化但不扩散。

3、PCR的基本原理是什么？

用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？

答：

）DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。

（2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。

4、cDNA克隆与基因组克隆有何不同？

答：

基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。

5、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去？

答：

化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。

这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。

0,什么是Western印迹？

它与Southern印迹有什么不同

答：

Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。

它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体（蛋白质）。

1、什么是蓝白斑筛选法？

答：

这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。

主要是在l载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的l载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷（X-gal）平板上形成浅蓝色的噬菌斑。

外源基因插人lac（或lac基因部分被取代）后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷（X-gal）平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。

2、什么是基因文库？

用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。

3、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。

答：

黏性末端连接法不足之处有：

（1）载体易自身环化；

（2）若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；（3）难插入特定的基因；（4）再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；（5）用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。

4、什么是同聚物加尾连接法？

用何种方法加尾？

具有哪些优缺点？

答：

所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA（dG）和dT（dC）,然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。

这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。

以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。

同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：

．

（1）首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。

（2）因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。

（3）用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。

同聚物加尾法也有一些不便之处：

（1）方法繁琐；

（2）外源片段难以回收。

由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。

另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。

5、何谓接头连接法？

答：

将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子（在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列），加到载体或外源DNA的分子上，这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点。

把这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子，这种方法称为接头连接法。

1、什么是基因组文库（genomiclibrary）?

构建基因组文库，涉及哪些基本过程?

它同遗传学上的基因库有什么不同?

答：

基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。

一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：

（1）高分子量染色体DNA的制备；

（2）体外重组连接；（3）包装蛋白的制备；（4）重组体的体外包装；（5）将重组DNA导人寄主细胞；（6）筛选。

基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。

基因库（genepool）是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。

在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。

1、常用的工具酶有哪些？

其主要用途是什么？

答：

限制性内切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA连接酶,碱性磷酸酶,末端脱氧核苷酸转移酶.限制性内切核酸酶,能够识别特异的DNA碱基序列，DNA碱基序列往往呈回文对称结构；DNA聚合酶a位于细胞核内，也许是复合物，有催化细胞增生的作用；Klenow大片段它也可以通过基因工程得到，分子量为76kDa。

DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。

碱性磷酸酯酶的作用是从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基。

末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到DNA分子的3`-OH末端。

2、重组DNA技术常包括哪些基本步骤？

答：

①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。

在具体工作中选择哪条技术路线；⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。

3、常用的目的基因的获取方法有哪些？

答：

直接获取从基因文库中提取目的基因，使用PCR扩增技术获得目的基因;人工合成.

4、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些？

答：

外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用．一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：

（1）实验步骤要尽可能地简单易行；

（2）连接形成的"接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；（3）对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

5、解释质粒，为什么质粒可作为基因载体。

答：

质粒是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质。

质粒：

（1）具有较小的分子量。

经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。

pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；

（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。

1、何谓限制性核酸内切酶？

写出大多数限制性核酸内切酶识DNA序列的结构特点。

答：

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA双链结构的水解酶.是在DNA分子内部切割，水解磷酸二酯键的核酸内切酶。

能够识别特异的DNA碱基序列，DNA碱基序列往往呈回文对称结构；并具有特异切割位点。

1、试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？

答：

外因：

是可以预见的，如反应条件（缓冲液、反应温度、反应时间、终止酶切的方法）、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积等等;内因：

星星活性、末端长度、位点偏爱、甲基化底物、底物的构象。

2、何为载体？

一个理想的载体应具备那些特点？

答：

将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体载体具备的特点：

①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制③有一定的选择标记，用于筛选④最好具有较高的拷贝数，便于制备。

3、什么叫基因工程（GeneEngineering），试从理论和技术两个方面谈谈GeneEngineering诞生的基础？

答：

基因工程：

在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。

理论基础：

近几十年来，由于受到分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学的研究取得了前所未有的进步。

而这些学科的综合成就，又为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础：

①在40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；②在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题；③在50年代末期和60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

技术基础：

①60年代-70年代，限制性核酸内切酶和DNA连接酶解决了对DNA分子进行体外的切割和连接；②基因克隆载体的出现③大肠杆菌转化体系的建立④60年代发展的琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术对DNA片段的分离和检测十分有用。

4、抗性基因是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？

并举两例说明其原理？

答：

氨苄青霉素抗性基因ampr、四环素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素和新霉素抗性基因kanr①氨苄青霉素抗性基因ampr:

青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应.氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化b-内酰胺环水解（水解青霉素），从而解除了氨苄青霉素的毒性。

②四环素抗性基因tetr：

四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。

四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。

5、YAC载体具有什么样的功能性元件？

为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？

答：

YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括自主复制序列ARS，一个着丝粒，两个端粒，选择标记，筛选模型。

优越性：

YAC能够容纳长达几百Kb的外源DNA，这是质粒和粘粒办不到的。

大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

YAC有灵活性，可作为质粒在E.coil中增殖；与大片段连接时，可导入酵母，作为真正染色体在酵母复制中有丝分裂。

1、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？

答：

同：

①原理相同。

琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质，可降低对流运动，故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。

在一定电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。

②凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小；浓度越高，空隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。

异：

琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为02.Kb-50Kb之间；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范围为1-1000bp，分离小片段效果最好，分辨率极高，相差1bp的DNA也可分开。

1.何谓Staractivity？

简述Staractivity的影响因素及克服方法？

答：

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。

引起星星活性的的因素：

①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/μl）；③低离子强度（<25mmol/L）；④高pH（>8.0）；⑤有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替Mg2+。

星星活性的抑制措施：

①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100～150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至7.0；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。

2.试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？

（影响酶活性的因素？

）

答：

外因：

反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短

内因：

星星活性、底物甲基化、底物的构象

3、DNA末端长度对酶切割的影响

答：

限制酶切割DNA时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。

在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。

一般需加3～4个碱基对。

4、何为载体？

一个理想的载体应具备那些特点？

答：

将外源DNA或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。

载体应具备：

①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选；④其它：

有一定的拷贝数，便于制备。

5抗性基因（Resistantgene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？

并举两例说明其原理？

答：

氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr,neor）以及琥珀突变抑制基因supF。

⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。

氨苄青霉素抗性Ampr编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。

⑵四环素与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。

Tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。

6.何为α-互补？

如何利用α-互补来筛选插入了外源DNA的重组质粒？

答：

α-互补指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。

α-互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。

实现α-互补主要有两部分组成：

LacZ△M15，放在F质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ'，放在载体上，作为筛选标记，当在LacZ'中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α-互补能力的β－半乳糖苷酶片断。

在诱导物IPTG和底物X-gal（同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解X-gal，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。

以此达到筛选的目的。

7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lyticgrowth和溶原状态Lysogenicstate两种循环的分化及其调节过程？

答：

裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。

溶原状态为λ噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA中随宿主的繁殖传到子代细胞。

调节过程：

由感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化的频率就越高。

溶源现象的生化媒介可能是3'--5'cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长另外一个重要的调节因素是噬菌体的CⅡ蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体DNA整合到细菌的染色体中去。

高浓度的CⅡ蛋白促进溶源化，而低浓度的CⅡ蛋白促进裂解生长。

当CⅡ蛋白浓度足够时，激活CⅠ蛋白和基因int的表达，导致噬菌体DNA与染色体整合，朝着溶源态生长。

9、cDNA文库的构建：

将来自真核生物的mRNA体外反转录成cDNA，与载体连接并转化大肠杆菌的过程。

⑴细胞总RNA的提取和mRNA的分离

⑵第一链合成：

由mRNA到cDNA的过程为反转录，由反转录酶催化。

⑶第二链合成：

①自身引物合成法②置换合成法③引导合成法④引物—衔接头合成法

⑷双链cDNA里连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖

10、文库质量检测

答：

文库质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素决定。

克隆数越多、平均插入片段的长度越长、插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量越好。

克隆数目可以通过多次转化累加，但并非越多越好，只要达到一定数目的基因组覆盖倍数和覆盖度就行，一般要求达到4—6倍覆盖率。

11、基因覆盖倍数的估算方法

答：

有两种，一：

用公式计算基因组覆盖倍数=平均插入片段的长度ⅹ克隆数/基因组DNA长度

二：

结合基因覆盖度检测来估算。

基因组覆盖度是指问苦衷克隆覆盖基因组的范围。

即选择一定数目的单拷贝基因作探针来筛选文库。

每个探针筛选的克隆数目，即为该基因位点的覆盖倍数。

12、解释并计算N=ln（1-P）/ln（1-f）

式中N：

代表一个基因组文库所包含重组克隆个数P：

代表所期望的目的基因在文库中出现的概率

f：

表示重组克隆平均插入片段的长度和基因组DNA长度的比值

计算：

大肠杆菌基因组大小约4.6mb，若P=99%，平均插入片段大小为20kb，f=20kb/4600kb,

则N=1057.即当期望从一个平均插入片段为20kb的大肠杆菌基因组文库中筛选到任意一个感兴趣的基因的概率达99%，该基因文库至少应包含1057个重组克隆。

选择合适的载体系统和挑去一定的阳性克隆是构建基因组文库时首先考虑的问题。

1、cDNA文库的均一化处理

两条途径：

基因组DNA饱和杂交法和基因组DNA饱和杂交法

⑴基因组DNA饱和杂交法

原理：

利用不同表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对一致的特点，可以对cDNA文库进行均一化处理

步骤①将基因组DNA用限制性内切酶消化固定，消化后的基因组DNA扁形为相对较短的单链且最大可能的覆盖基因组。

②分离纯化独立cDNA文库的混合质粒

③文库cDNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固定住相应的cDNA，并将它洗脱重新转化受体菌。