微生物学实验报告.docx

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微生物学实验报告

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微生物学实验报告

实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察

第一部分：

显微镜的使用

一、目的要求

1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。

2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。

3．了解各种显微镜的主要特征。

二、实验原理

（一）光学显微镜的构造

微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。

1、机械部分

普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：

目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。

2、光学部分：

目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。

（二）放大倍数

标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。

总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。

物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。

显微镜的放大倍数

放大倍数

总的放大倍数

低倍镜

高倍镜

油镜

物镜

10×

45×

100×

目镜

10×

10×

10×

100×

450×

1000×

（三）分辨距离与分辨力

显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。

分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。

因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。

R=0.61λ/N.A

式中：

R-----分辨距离；

λ------作用光的波长；

N.A------数值口径。

一些介质的折射率

介质

折射率

空气

水

玻璃

香柏油

1

13

55

1.56

三、实验内容

（一）材料：

显微镜，香柏油，擦镜纸。

（二）方法：

细菌很小，须使用油镜方可观察到。

油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法：

1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。

2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。

在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。

然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。

如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。

3、更换标本时应先提高油镜头，再更换玻片，切勿随意移动显微镜的位置。

4、油镜观察完毕后，按“显微镜保护”中（6）项处理。

5、最后将油镜各部分还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形，以免与聚光器发生碰撞。

四、思考题

1、使用显微镜时为何调节下列构造？

反光镜，光圈，聚光器，粗调节器，细调节器，镜头回转器。

答：

聚光器的位置之升降可影响视野的明亮度，上升则视野明亮，下降则光线减弱。

光圈的放大或缩小也可控制视野明亮程度。

粗调节器和细调节器均是调节焦距的装置。

镜头回转器为装置物镜和转换物镜之用。

2、使用不同放大倍数的物镜时，工作距离与光圈的关系。

如何利用这一原理用好显微镜？

答：

物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短。

标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。

总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。

3、为何要选用与玻璃折射率相似的香柏油作为油镜的介质？

油镜的原理是什么？

答：

香柏油只在使用油镜头时（100倍物镜）使用，因为当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。

当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。

可见光的波长平均为0.55μm。

当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。

选用香柏油是因为它的折射率是1.515

4、显微镜有哪几种？

各自的主要特征是什么？

答：

光学显微镜中除明视野显微镜外，还有暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜；除光学显微镜外，还有电子显微镜。

暗视野显微镜：

在普通光学显微镜载物台下安装一个暗视野聚光器即成暗视野显微镜。

相差显微镜：

相差显微镜成像的原理和普通光学显微镜一样，所不同的是相差显微镜包括有环状光阑、装有相板的相差物镜和全轴调整望远镜三个特殊部分。

荧光显微镜：

荧光显微镜的主要特征是以紫外线为光源，当照射到用荧光素标记的细菌时，荧光素吸收了紫外线的能量后，再发射出可见的橙、黄、浅绿色荧光。

由于用荧光素标记的菌体各种结构中的溶解、吸附或化合情况不一，于是发出不同色调和亮度的荧光，从而可以观察细菌的不同结构。

电子显微镜：

电子显微镜的基本结构和工作原理与普通光学显微镜非常相似，不同的是用电子流代替光线，用电磁圈代替透镜聚焦。

第二部分：

细菌形态学检查方法

一、目的要求

1、了解不染色标本检查法，用悬滴法观察活细菌及其动力。

2、熟悉染色标本的制备过程，掌握革兰氏染色法及其结果判断，了解革兰氏染

色法原理。

3、了解其它常用染色法。

二、实验原理

检查细菌形态的主要工具是显微镜，可根据不同目的将细菌染色或不染色进行镜检。

常用的碱性染料有结晶紫、美蓝、碱性复红等。

染色法又分单染色法和复染色法两大类。

单染色法即仅用一种染料着色，所有的细菌均被染成一种颜色，无鉴别细菌的作用。

复染色法又称鉴别染色法，通常用二种或二种以上的染料着色，由于不同种类的细菌或同种细菌的不同组成结构对染料有不同的反应性而被染成不同的颜色，从而有鉴别细菌的作用。

2、最常用的细菌复染色法是革兰氏染色法（Gramstain）。

通过革兰氏染色法操作，可把细菌分成两大类：

革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。

凡能使第一种染料结晶紫保留蓝色的细菌叫革兰氏阳性细菌，凡被洒精脱色后染上对比颜料沙黄或稀释复红而呈红色的细菌叫做革兰氏阴性细菌。

三、实验内容

（一）染色标本的制备及观察

1、复染色法（革兰氏染色法）

材料：

葡萄球菌琼脂培养物1支

大肠杆菌琼脂培养物1支

革兰氏染液一套：

结晶紫、95%酒精、路哥氏碘液、稀释复红各1瓶。

玻片，接种环，酒精灯，吸水纸等。

方法：

（1）涂片用葡萄球菌和大肠杆菌混合涂片。

①取玻片一块，拭净。

②用无菌接种环取生理盐水一滴，放在玻片中央（如被检材料是液体，可不加生理盐水）。

③左手斜持菌种试管，右手将菌种试管棉塞稍加转动，以便拔下。

④右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小拇指拔开菌种试管棉塞，试管口通过火焰，将接种环插入试管中取菌少许（切不可多，更不可将培养基刮下）。

⑤试管口再通过火焰，塞好棉塞。

⑥将接种环上的细菌加入玻片上之水滴内，磨匀，涂成直径为1cm大小的薄菌膜。

⑦接种环经火焰灭菌。

.

（2）干燥涂片置于空气中，使其自然干燥。

（3）固定干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次，此为“固定”。

目的是使细菌粘于玻片上，染色和水冲时不易脱落；且细菌为蛋白质，被热凝固可保持完整形态。

（4）染色初染→媒染→脱色→复染

①加结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1~2分钟。

②细水冲洗。

③加路哥氏碘溶液经1分钟。

④水洗。

⑤加95%酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。

如此重复2~3次（约30秒钟）。

⑥水洗。

⑦加稀释复红染液，染约1分钟。

⑧水洗，用吸水纸吸干。

（5）镜检革兰氏阳性菌在结晶紫着色后不易被酒精脱色，故仍为深蓝色或紫色；革兰氏阴性菌在结晶紫着色后易被酒精脱色，故经稀释复红复染后成红色。

三、实验记录

革兰氏染色过程：

取玻片一块，在玻片上滴三小滴水（有一定的距离），分别用接种环取EC（大肠杆菌）和BS（金黄色葡萄球菌）与两边的水滴上，并混匀，灼烧接种环后再分别取EC和BS于中间的水滴上混匀（即中间水滴是两种菌的混合物），并在酒精灯下灼烧至干（小心不要将玻片炸裂），用结晶紫进行初染，细水冲洗后，加路哥氏碘液进行媒染，水洗后加酒精脱色2~3次，水冲洗后加稀释复红染液复染一分钟，水洗，并用吸水纸吸干。

大肠杆菌为革兰氏阴性菌，染色后呈紫红色。

普葡萄球菌为革兰氏阳性菌，染色后呈现蓝紫色。

以下为实验观测图：

四、思考题

1．染色法在微生物学上有何实际意义？

染色法可以更方便的观察细菌的具体形态，更方便观察细菌，革兰氏染色法有更重要的意义，可以鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，在实验方面，可以通过杀死阳性或阴性菌而得到目的菌。

2．比较复染色法与单染色法的优缺点。

答：

单染色法：

优点：

仅用一种染料着色，所有的细菌均被染成一种颜色，简单方便，可用来观察细菌的形态和排列方式。

缺点：

但无鉴别细菌的作用。

复染色法：

优点：

用二种或二种以上的染料着色，由于不同种类的细菌或同种细菌的不同组成结构对染料有不同的反应性而被染成不同的颜色，从而有鉴别细菌的作用。

缺点：

使用试剂较多，过程较单染色法更复杂繁琐。

3．以革兰氏染色法为例，说明它至少要涉及几种试剂？

各起何作用？

答：

至少用到4种试剂。

结晶紫溶液进行初染，路哥氏碘液进行媒染，95%酒精进行脱色，稀释复红染液进行复染。

4．要确证一个未知细菌的革兰氏染色性质，你可用什么方法来说明你的结果是可靠的？

答：

通过在显微镜下的菌体被染的颜色可以判断，凡能使第一种染料结晶紫保留蓝色的细菌为革兰氏阳性细菌，凡被洒精脱色后染上对比颜料沙黄或稀释复红而呈红色的细菌为革兰氏阴性细菌。

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实验二培养基的的制备灭菌及接种技术

培养基的制备和灭菌

一、目的要求

掌握基础培养基应具备的条件及其制备方法。

二、实验原理

培养基是人工配制的供给细菌或其它微生物生长繁殖的营养基质。

微生物的种类虽然繁多，但对基本营养物质如碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水分等的要求却有共同性。

这些营养物质的作用是：

提供合成菌体和代谢产物的原料；提供生命活动必需的能量；调节代谢环境。

作为培养基必须具备下列条件：

①含有适当的水分和一定配比的适宜的营养物质。

②具有合适的酸碱度（pH值）。

③有适当的物理状态：

液体培养基、固体培养基和半固体培养基。

④培养基必须经灭菌成为无菌状态后方能使用。

利用培养基对细菌等进行人工培养，在微生物学上有重要意义。

例如，细菌纯培养物的分离、培养，细菌生物学特性的研究、分类鉴定，菌种保藏等都需要利用培养基进行人工培养。

同时在传染病的诊断、生物制品的研制、发酵生产，以及利用细菌等作为工具进行的其它学科的研究中（如遗传学、基因工程等），都离不开培养基的应用和细菌的人工培养。

基础培养基一般指的是营养肉汤培养基和营养琼脂培养基，它通常由蛋白胨（主要作为氮源）、牛肉浸膏（作为碳源、氮源、维生素和无机盐）、氯化钠（无机盐并具有维持一定的渗透压的作用）和水所组成。

基础培养基含有大多数细菌生长繁殖所需要的营养物质。

另外，根据培养基的组成和使用目的菌不同，还有加富培养基、选择培养基、厌氧培养基等。

三、实验内容

（一）马丁培养基的配制：

葡萄糖10.0g、

蛋白胨5.0g、

磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g、

硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g、

孟加拉红33.4mg、

蒸馏水1000mL、

实验中使用的是已经配制好的培养基粉，称取36g，加入1000ml水，分装在两个500ml的锥形瓶中，包扎，置于高温灭菌锅中121℃下灭菌30min。

灭菌后进行倒平板备用。

四、思考题

1．液体培养基、固体培养基、半固体培养基各有何功用？

答：

液体培养基：

组分均一，适宜各类微生物的营养生长。

广泛应用于实验研究及大规模工业生产中，有利于广泛获得大量菌体或代谢产物。

固体培养基：

琼脂固体培养基广泛应用于微生物的分离培养、菌种鉴定和保藏。

半固体培养基：

用于观察细菌的运动、菌种鉴定及测定噬菌体的效价等。

2．细菌的人工培养需要哪些条件，在微生物学上有何重要意义？

答：

需要基本营养物质：

如碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水分等。

细菌纯培养物的分离、培养，细菌生物学特性的研究、分类鉴定，菌种保藏等都需要利用培养基进行人工培养。

同时在传染病的诊断、生物制品的研制、发酵生产，以及利用细菌等作为工具进行的其它学科的研究中（如遗传学、基因工程等），都离不开培养基的应用和细菌的人工培养。

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实验三自然界中微生物的分离与纯化

一、目的要求

1、学习并掌握从自然界中分离微生物的方法。

2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法；

二、基本原理

土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。

不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。

一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。

本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的是平板分离法和划线分离法，纯化该微生物，直至得到纯菌株。

平板分离法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

该法虽然操作繁琐，但可获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。

三、实验材料

（一）菌源

1、土样：

选定采土地点后，铲去表土层2~3cm，取3~10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。

土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。

（二）培养基（制平板）

1、马丁培养基：

葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g、孟加拉红33.4mg、蒸馏水1000mL、121℃30min灭菌。

（三）无菌水

配制无菌水，分装于250mL锥形瓶，每瓶装99mL），每瓶内装4~4粒玻璃珠。

分装试管、每管装9mL（每组4支），121℃灭菌20min。

（四）其他物品：

无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。

四、操作步骤

（一）稀释涂布平板分离法

（1）制备土壤稀释液

称取土样10g，放入到盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡10~20min，使土壤均匀分散成土壤悬液（10－1）。

用1mL的无菌移液管从中吸取1mL土壤悬液，移入到分装有9mL无菌水的试管中，吸吹3次，振荡均匀（10－2）。

用同样方法依次制成10－2~10－4的土壤稀释液（为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管）。

（2）涂布法分离

依前法向无菌培养皿中倾倒已融化的培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述10-1、10-2、10-3、10-4四个稀释度菌悬液0.2mL，依次滴加于相应编号已制备好的培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀（一定要多涂几遍，涂到菌液均匀分布为止，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破）。

将平板倒置于恒温箱中进行培养，观察结果。

（二）平板菌落形态及个体形态观察

从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，观察各种霉菌菌落的形态特征。

五、实验记录

1、样品来源：

学校某草地中的肥沃土壤。

使用稀释涂布平板分离法对霉菌进行分离，所用培养基为马丁培养基，稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4，37°C恒温培养箱中培养了3天。

2、用10-1浓度和10-2浓度的土壤稀释液筛选出来的霉菌长势非常好，有黄曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、绿色孟霉菌；而10-3、10-4培养基中基本无菌长出。

黄曲霉菌：

黄色，表面粉末状，呈放射状排列，黄色，顶端有链状孢子，菌落较大。

黑曲霉菌：

表面黑色，粉末状，周围有粒型孢子，菌落较大，有一个菌落生出绒毛状菌丝。

绿色孟霉菌：

菌落圆形紧密，绒毛状，羊毛状，呈暗灰绿色，呈放射状排列，菌落适中。

毛霉菌：

呈白色，绒毛状，白色小圆点，菌落较小。

从左到右土壤稀释液浓度依次为10-1、10-2、10-3、10-4：

对各个培养基进行菌落计数：

10-1浓度：

黑曲霉菌：

9个；黄曲霉菌：

4个；毛霉菌：

11个；绿色孟霉菌：

33个。

总菌落数：

57个。

10-2浓度：

黑曲霉菌：

4个：

黄曲霉菌：

3个：

毛霉菌：

6个；绿色孟霉菌：

10个。

总菌落数：

23个。

10-3浓度：

毛霉菌：

3个。

总菌落数：

3个。

10-4浓度：

毛霉菌：

1个。

总菌落数：

1个。

霉菌总菌落数随土壤稀释液浓度从高到低逐渐减少，说明浓度越低的土壤稀释液中含菌数越少。

3、在恒温箱中培养微生物时为何培养皿均需倒置？

答：

①防止培养基水分蒸发②防止冷凝水的流动造成平板表面的“交叉感染”，响单个菌落的形成③防止外物掉在培养基上。

4、分离某类微生物时培养皿中出现其他类微生物，应该如何进一步分离和纯化？

答：

用接种环挑取所需微生物接种到新的培养基中进行培养。