届高考生物一轮复习第十二单元生物技术实践第40讲微生物的培养与应用学案.docx
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届高考生物一轮复习第十二单元生物技术实践第40讲微生物的培养与应用学案
第40讲 微生物的培养与应用
1．微生物的分离和培养 2.某种微生物数量的测定 3.培养基对微生物的选择作用
4．利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用
培养基及微生物的纯化培养技术
1．培养基
（1）概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）营养组成：
一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
（3）分类
2．无菌技术的主要方法及适用对象[连一连]
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
4．纯化大肠杆菌
（1）原理：
在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
（2）主要方法及纯化原理
主要方法
平板划线法
稀释涂布平板法
平板示
意图
纯化原理
通过连续划线操作实现的
将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现的
5.菌种的保藏方法
（1）临时保藏法：
对于频繁使用的菌种，先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4℃的冰箱中保藏。
（2）甘油管藏法：
对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中，混匀后放在－20℃冷冻箱中保存。
（选修1P18“旁栏小资料”改编）微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？
微生物接种的核心是什么？
答案：
不是。
微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，其核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
考向1 培养基及其制备方法及无菌技术的操作
1．（2018·湖南长沙浏阳四中一模）高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。
研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图所示。
回答下列问题：
（1）Ⅰ号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入________作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，应以________作为唯一碳源。
（2）配制固体培养基的基本步骤是（ ）
A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
（3）溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地________，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。
对培养基灭菌的方法一般为________________。
（4）①过程是________，②过程所使用的接种方法是____________法。
（5）部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到Ⅱ号培养基上进一步分离纯化后，再对菌种进行________培养。
解析：
固体培养基通常加入琼脂作为凝固剂。
本实验的目的是获得产生高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。
配制固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
配制培养基加热溶化时，要注意加入琼脂后要不断搅拌，防止琼脂糊底和溢出。
对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌。
仔细观察题图可知，过程①是菌液稀释，过程②是采用涂布法接种。
能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透明圈，取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种，以后可以扩大培养用于生产。
答案：
（1）琼脂 淀粉
（2）C （3）搅拌 高压蒸汽灭菌
（4）稀释 稀释涂布平板 （5）淀粉酶 扩大
考向2 微生物的纯化技术
2．（2017·高考江苏卷）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。
小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。
请回答下列问题：
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有______________。
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。
若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。
制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。
（3）如图为连续划线法示意图，在图中________（填图中序号）区域更易获得单菌落。
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。
先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度（mg/L）
1
如果废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________（填序号：
①5 ②10
③20）倍后，再进行比色。
解析：
（1）富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含C的有机物，可作为碳源。
（2）欲富集酚降解菌，需随转接次数增加逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养
基，除含有水、营养物质（碳源、氮源、无机盐等）外，还需添加琼脂作为凝固剂。
（3）利用连续划线法接种时，最后的划线区域（③）中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。
（4）因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；根据题意，废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1mg/L，需将残留液稀释20倍左右。
答案：
（1）蛋白胨、苯酚
（2）增加 稀释涂布 凝固剂 （3）③ （4）0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
两种纯化细菌方法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于
好氧菌稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）分离原理：
土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
（2）统计菌落数目：
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
2．实验流程
3．分解尿素的细菌的鉴别
（1）方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。
（2）原理：
（3）实验现象及结论
①培养基变红：
该种细菌能分解尿素。
②培养基不变红：
该种细菌不能分解尿素。
4．设置对照和重复
项目
对照
重复
目的
排除非测试因素对实验结果的影响
排除偶然因素对实验结果的影响
实例
空白对照：
确定培养基制作是否合格
同一稀释度涂布至少3个平板
（选修1P26“旁栏小资料”改编）细菌数目的测定还有哪些方法？
举例说明。
答案：
滤膜法。
测定饮用水中大肠杆菌的数目可以采用滤膜法。
1．（2017·高考全国卷Ⅰ）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。
回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________________。
能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________________________
（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________________
（答出两点即可）。
解析：
（1）能分解尿素的细菌体内应含有脲酶；能分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物，可用葡萄糖等有机物作为碳源。
进入细菌体内的葡萄糖既能为细胞生命活动提供能量，又可为其他有机物的合成提供原料。
（2）筛选可分解尿素的细菌，应选择以尿素为唯一氮源的培养基，而能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，其他两组不能起到筛选作用。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，这两种物质既可为细菌生长提供无机营养，又可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH相对稳定。
答案：
（1）脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
（2）尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
（3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2．（2018·广西来宾中学模拟）下表是某同学列出的分离并计数土壤中微生物培养基的配方，据此回答下列问题：
（1）制备培养基时，将上述物质溶解并用蒸馏水定容至1000mL后，还要进行________和________。
（2）从功能上看，该培养基属于________培养基，细菌能利用培养基中的氮源是由于能合成________。
（3）用稀释涂布平板法统计样本菌落数时，__________（填“需要”或“不需要”）设置对照组（即不接种进行培养），原因是________________________________________________________________________。
（4）某同学在3个培养基上分别涂布稀释倍数为106的土壤样液0.1mL，培养一段时间后，其菌落数分别为180、220、320个，则1mL原土壤样液中上述微生物的数量为________，此方法测定的活菌数比实际活菌数少的原因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：
（1）用稀释涂布平板法统计的菌落数，制备培养基时，将上述物质溶解并用蒸馏水定容至1000mL后，还要进行灭菌和倒平板。
（2）该培养基中含有的尿素为唯一氮源，是选择培养基，细菌能合成脲酶，能利用尿素。
（3）用稀释涂布平板法统计样本菌落数时需要设置对照组，主要用于判断培养基是否被杂菌污染。
（4）1mL原土壤液中上述微生物数量＝（180＋220＋320）÷3×106×10＝2.4×109个，用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低的原因是培养基上的菌落可能是由两个或多个细菌形成的。
答案：
（1）灭菌 倒平板
（2）选择 脲酶（催化尿素分解的酶）
（3）需要 判断培养基是否被杂菌污染
（4）2.4×109 当两个或多个细菌连在一起时，平板上只能观察到一个菌落
两种计数方法的比较
项目
间接计数法
（稀释涂布平板法）
直接计数法
（显微计数法）
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝（C÷V）×M
C：
某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：
涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：
稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：
每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素与纤维素酶
（1）纤维素：
一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。
（2）纤维素酶
①组成：
纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。
②作用
纤维素
纤维二糖
葡萄糖
2．纤维素分解菌的筛选
（1）方法：
刚果红染色法。
（2）培养基：
富含纤维素的选择培养基。
（4）菌落的挑选：
挑选产生透明圈的菌落。
3．实验流程及注意事项
1．（2018·四川成都七中模拟）为获得果胶酶高产菌株，科研人员进行了下列分离、筛选、鉴定工作。
回答下列问题：
（1）为分离果胶酶产生菌，科研人员配制了下表所示成分的培养基，该表空白处的两种成分是________________。
制备的培养基常用________________法进行灭菌。
K2HPO4
MgSO4
NaNO3
FeSO4
琼脂
0.1g
0.5g
3g
0.01g
2g
15g
加至1L
（2）科研人员将采集的果园土壤放入无菌水中，震荡混匀，制成悬液。
为获得较均匀分布的单菌落，还需要将悬液进行________，用________法接种于固体培养基上。
接种后的培养基呈________状态放入培养箱。
（3）选择单菌落数目适宜的培养基，加入一定浓度的刚果红溶液（果胶与刚果红结合后显红色），一段时间后洗去培养基表面的刚果红溶液，观察并比较菌落的________直径的比值，筛选果胶酶高产菌株。
（4）将获得的菌株进行液体培养后，从培养液的________（填“上清液”或“沉淀物”）获得粗提的果胶酶。
将一定量的粗提果胶酶与适量果胶溶液混合，一定时间后测定吸光值来测定酶活性。
进行吸光值测定时，需将____________________与等量果胶溶液混合，作为实验的对照。
解析：
依题意可知：
该实验的目的是分离果胶酶产生菌，因此培养基中需要加入果胶，在配制过程中需用蒸馏水定容，所以该表空白处的两种成分是果胶和蒸馏水。
制备的培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
答案：
（1）果胶和蒸馏水 高压蒸汽灭菌
（2）梯度稀释（或系列稀释） （稀释）涂布平板 倒置
（3）水解（或透明）圈
（4）上清液 等量失活的粗提果胶酶
2．（高考新课标全国卷Ⅰ）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。
回答下列问题：
（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。
（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成________色复合物。
用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见表）：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维
素粉
琼脂
CR溶液
水
培养
基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养
基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：
“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
培养基乙________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________________________________________________________。
解析：
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。
（2）刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
（3）纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
答案：
（1）纤维二糖 葡萄糖
（2）红 透明圈
（3）不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
两种刚果红染色法的比较
项目
方法一
方法二
优点
传统的方法，显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
操作简便，不存在菌落混杂问题
缺点
操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂
①由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；
②有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成的明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分
[清一清]
易错点1 误认为所有微生物培养基中均需加入“生长因子”
[点拨] 碳源、氮源、水分、无机盐、生长因子是微生物生长必需的五大营养成分，但大多数培养基中都含碳源、氮源、水分、无机盐四类物质，可能不需额外添加“生长因子（如维生素）”，这是因为许多微生物可自行合成这些生长因子，而对那些合成能力有限或不能合成生长因子的微生物（如乳酸菌），则需在培养基中添加诸如维生素等生长因子。
易错点2 消毒≠灭菌
[点拨]
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温
和的物
理或化
学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的
理化因
素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器的灭菌
易错点3 两种微生物筛选方法的比较
[点拨]
项目
土壤中分解尿素的细菌的分离
分解纤维素的微生物的分离
方法
使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养
利用富含纤维素的选择培养基进行培养
原理
土壤中不能分解尿素的微生物因缺乏脲酶而不能正常生长，能够分解尿素的微生物能利用尿素为氮源正常生长，从而起到选择作用
因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖
特有
代表
过程
CO（NH2）2＋H2O
CO2＋2NH3
纤维素
纤维二糖
葡萄糖
易错点4 不知道菌落计数比实际值“偏高”还是“偏低”
[点拨] 稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。
这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
而显微计数法中由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能“偏高”。
[判一判]
（1）培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质（ ）
（2）倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上（ ）
（3）消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害（ ）
（4）为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落（ ）
（5）用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落（ ）
（6）选择培养基可以鉴定某种微生物的种类（ ）
（7）对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法（ ）
（8）筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源（ ）
（9）分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低（ ）
（10）刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌（ ）
（11）土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养”是必不可少的（ ）
（12）在富含纤维素的培养基中加入刚果红染色剂，若出现周围存在透明圈的菌落，则说明筛选到了分解纤维素的微生物（ ）
（13）在纤维素分解菌的选择培养基上生长的菌落都是纤维素分解菌（ ）
（14）培养基中出现透明圈的菌落一定是纤维素分解菌的菌落（ ）
答案：
（1）√
（2）× （3）√ （4）× （5）√ （6）× （7）× （8）√ （9）× （10）× （11）× （12）√ （13）× （14）×
（2016·高考全国卷Ⅰ）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。
某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。
实验步骤如下：
①配制培养基（成分：
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于________________________________________________________________________。
若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。
（2）步骤③中，实验组的操作是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。
若将30（即36－6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________（填“正确”或“不正确”）。
解析：
（1）牛肉膏和蛋白胨都含有蛋白质的水解产物，都可以作为氮源；观察菌落需利用固体培养基，因此可推知若要完成步骤②，该培养基中的成分X
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