DNA的粗提取和鉴定.docx

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DNA的粗提取和鉴定

DNA的粗提取与鉴定

　　●教材分析

　　本实验既是对组成细胞化合物的验证，也是加强学生对细胞中化合物的提取原理、方法、技巧的理解掌握，同时还是历年来各种考核的热点。

因此，本实验的成功与否关系重大。

　　教材首先介绍了该实验的“实验原理”。

（1）DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的。

（2）利用DNA不溶于酒精而细胞中的某些物质能溶于酒精进行提纯。

（3）利用DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色进行鉴定。

　　教材接着说明了DNA的粗提取与鉴定的目的要求。

要求学生初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。

　　教材第三部分清楚地列出了该实验的材料用具。

特别是所列酒精、蒸馏水、柠檬酸钠溶液、氯化钠溶液、二苯胺试剂，在实验中一定要搞清楚它们的作用。

　　教材第四部分更为详细地介绍了该实验的方法和步骤。

从取鸡血细胞、DNA的提取过程，一直到用二苯胺进行鉴定点滴不漏地作了说明。

　　为此，我们从如下几方面对该实验做了本质性的准备。

　　1．知识结构的联系：

明确鸡血细胞的结构和物质组成，它是由细胞膜、细胞质、细胞核构成；细胞核又包括核膜、核液、核仁、染色质（染色体）；染色质主要是由DNA和蛋白质组成的，所以要想对DNA进行提取，必须把细胞破碎，然后采用相应的原理和方法才能提取出来。

　　2．相关知识的迁移：

掌握该实验的知识点，对巩固《生命的物质基础》（核酸）、《生物的生殖和发育》（减数分裂、受精作用过程中DNA含量的变化）、《遗传和变异》以及“基因工程”打下较好的理论基础。

　　3．实验操作的关键：

该实验成败的关键是提取。

一则选材，鸡血细胞核DNA含量丰富且易得；再者，鸡血细胞很易吸水胀破。

二则DNA的粗提取中必须通过几次准确的氯化钠浓度变化方可，否则提取的量不足。

所以教师必须精心设计，认真组织，否则，实验难以成功。

　　●教学目标

　　知识目标

　　识记：

获得鸡血细胞的方法。

　　理解：

（1）提取鸡血细胞核物质的方法；

（2）提取含杂质较少的DNA的方法；

　　　　（3）DNA鉴定的方法。

　　能力目标

　　1．理解相关溶液的作用机理，培养学生的分析能力。

　　2．通过DNA的粗提取，培养学生的动手能力。

　　情感目标

　　1．通过小组成员相互配合实验，培养学生的合作精神。

　　2．通过实验结果，使学生树立生命的物质性。

　　●重点·落实方案

　　重点

　　1．掌握DNA的粗提取与鉴定的技术。

　　2．理解各步骤中的实验原理。

　　落实方案

　　1．对每小组进行关键步骤的指导。

　　2．对每关键步骤的原理进行分析讲解。

　　●难点·突破策略

　　难点

　　DNA的粗提取。

　　突破策略

　　1．板书DNA的粗提取程序和重要环节。

　　2．引导学生理解各种溶液的用途或作用。

　　●实验原理

　　1．DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。

当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。

利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。

　　2．DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。

利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。

　　3．DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

　　●材料用具

　　材料

　　鸡血细胞液；预冷的95%的酒精溶液；蒸馏水；质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液；物质的量浓度分别为2mol/L和0.015mol/L的氯化钠溶液；二苯胺试剂。

　　用具

　　铁架台、铁环、镊子、三角架、酒精灯、石棉网、载玻片、玻璃棒、滤纸、滴管、量筒、烧杯（不同大小）、试管、漏斗、试管夹、纱布。

　　●做法指导

　　指导学生预习：

结合教材的知识结构和实验目标预习该实验内容，从理论上掌握鸡血细胞的获取；鸡血细胞核物质的提取及纯化和鉴定方法。

　　指导学生提取：

（1）让鸡血细胞在低渗溶液中吸水胀破，释放最多的DNA。

（2）让DNA处在0.14mol/L的氯化钠溶液中尽可能地析出。

（3）用预冷的95%的酒精尽可能除去其他细胞物质，得到更纯化的DNA。

　　●课时安排

　　1课时

　　●教学过程

　　［导课］

　　1．为什么说DNA是主要的遗传物质？

有何证据？

　　2．科学家为什么把噬菌体作为研究DNA是遗传物质的材料？

DNA存在于细胞的什么结构中？

　　上节课，我们学习了DNA是主要的遗传物质，并通过实验证明了DNA是主要的遗传物质。

在上节教材中，我们从理论上明确了DNA主要存在于细胞核的染色体上。

本节课我们将通过实验对此给予证明。

（出题：

DNA的粗提取和鉴定）

　　［教学目标达成］

　　1．板书：

制鸡血细胞液（加抗凝剂）→获鸡血细胞（离心或静置）→获鸡血细胞核物质（提取→溶解→析出→溶解→析出）→鉴定DNA（用二苯胺）

　　指导学生按教材给出的具体步骤和板书的程序完成实验。

指导过程中，要特别关注浓度这一关键因素。

实验开始，教师要提供已经制备好的鸡血细胞液。

　　2．通过实验操作，获得鸡血细胞核物质。

（1）应用低渗原理和机械搅拌使细胞破裂并过滤。

本步骤直接决定提取的核物质的多少及实验结果。

教师应给予非常关注。

（2）溶解细胞核内DNA。

加2mol/L的NaCl溶液并用玻棒搅拌。

　　（3）析出DNA黏稠物并过滤。

关键步骤：

注意①注蒸馏水要慢，防过量而使DNA重新溶解（把握浓度达0.14mol/L）。

②轻轻沿同一方向搅拌，有利于DNA析出、附着、缠绕。

　　（4）再溶解DNA黏稠物并过滤。

用浓度为2mol/L的NaCl溶液。

　　（5）提取含杂质较少的DNA。

用预冷的95%的酒精。

因其①可抑制核酸水解酶活性，防止降解。

②降低分子运动，易析出沉淀。

③低温利于增加DNA柔韧性，减少断裂。

　　3．DNA鉴定。

用二苯胺在沸水浴中与DNA作用出现蓝色。

注意设对照实验。

　　注意事项：

①学生在操作中常常发生：

不能形成黏稠物、制取的DNA粗制品有红色（血红蛋白颜色）或由于加入溶液和搅拌过程不科学导致实验现象不明显等现象。

②实验过滤用两层纱布效果较好。

③使用玻棒用细玻棒效果更佳。

　　4．操作完成后，投影显示如下表格并明确各步骤目的：

引导学生讨论、回忆并回答目的①~⑨。

　　①防止血凝。

　　②加速血细胞破裂。

　　③溶解DNA。

　　④使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L，促DNA最大限度地析出。

　　⑤使含DNA的黏稠物被留在纱布上。

　　⑥使含DNA的黏稠物尽可能多地溶于溶液中。

　　⑦除去含DNA的滤液中的杂质。

　　⑧提取DNA。

　　⑨A：

出现蓝色。

　　B：

无变化

　　5．讨论与结论。

投影给出如下讨论提纲，供学生讨论。

（1）DNA粗提取过程中的关键是哪几步？

（2）提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液？

　　（3）DNA的直径约为2nm，实验中出现的丝状物的粗细是否表示一个DNA分子直径的大小？

　　学生分组进行讨论并发表讨论结果。

教师对讨论进行全程指导，并与学生一起归纳总结。

（1）a．提取鸡血细胞的核物质。

应用低渗原理和机械搅拌，可得到最大量的DNA。

　　　　b．析出DNA黏稠物。

加蒸馏水要慢，搅拌要轻。

　　　　c．沉淀DNA时，必须用冷酒精。

（2）提取DNA，去除杂质是关键。

由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去（含蛋白质）。

　　（3）实验中出现的丝状物是肉眼可以观察到的，这种丝状物的直径要比DNA分子的直径2nm大许多倍，所以实验中出现的丝状物并不表示一个DNA分子的直径。

　　实验结论：

细胞中有DNA，DNA遇二苯胺试剂在沸水浴中变蓝色。

　　［教学目标巩固］

　　1．实验中步骤1和步骤3都需要加入蒸馏水，两次加入的作用相同吗？

为什么？

　　2．实验中NaCl的物质的量浓度为2mol/L和0.14mol/L对DNA有何影响？

　　3．DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成

　　A．砖红色　B．橘黄色　C．紫色D．蓝色

　　学生回答：

（略）

　　［布置作业］

　　将实验中观察到的现象和得出的结论填写在《实验报告册》上。

　　［结课］

　　这节课咱们验证了细胞是由化合物按照一定的方式组成的这一结论。

从知识结构角度来说，一要加深对生物的物质性理解；二要掌握一般的物质提取方法；三要注意不同的化学物质要用不同的原理鉴定。

从实验过程角度来说，要理解各种溶液和试剂的作用和目的。

　　●板书设计

　　●备课资料

　　一、二苯胺试剂的配制

　　A液：

1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存。

如冰醋酸呈结晶状态，则需加温后待其熔化，再使用。

　　B液：

乙醛的体积分数为0.2%的溶液。

　　配制：

将0.1mLB液加入到10mLA液中，现配现用。

　　二、实验原理的补充介绍

　　1．DNA的释放：

DNA位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下不会释放出来。

为了使DNA从细胞核中释放出来，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。

蒸馏水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞破裂。

同时，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），于是释放出DNA，当然也有RNA。

但是，释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。

　　2．将DNA与蛋白质分离：

根据二者的特性，即在浓度较高的NaCl溶液（物质的量浓度为2mol/L）中，核蛋白容易解聚，游离出DNA。

而DNA在浓度较高的NaCl溶液中的溶解度很高，Na＋与带负电的DNA结合成DNA钠盐。

这时DNA在溶液中呈现溶解状态。

　　3．DNA的析出与获取：

利用DNA在浓度较低的NaCl溶液中溶解度小的原理，向含有DNA的浓度较高的NaCl溶液中加入大量（300mL）蒸馏水，稀释NaCl溶液，使DNA的溶解度下降，而蛋白质的溶解度增高（这就是蛋白质的盐溶现象），从而使二者分离。

这时，加上不停地搅拌，溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。

再通过过滤，滤去蛋白质，就可以获取DNA的黏稠物了。

如果采用离心法则更好，用4000r/min的旋转频率，离心15min，除去上清液（含有蛋白质），留下的沉淀物中含DNA。

　　4．DNA的再溶解：

再用较高浓度的NaCl溶液去溶解DNA黏稠物。

　　5．DNA的沉淀和浓缩：

除去了蛋白质的核酸溶液，必须再进一步沉淀和浓缩。

最常用的方法是酒精沉淀法。

就是将含有Na＋的DNA溶液，加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中，混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。

如果出现的丝状物较少，可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。

浓缩后的DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起（因为玻璃棒有吸附DNA的作用）。

　　6．DNA的鉴定：

本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。

二苯胺法的原理是：

DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成w—羟基—r酮基戊醛，它再和二苯胺作用而显现蓝色（溶液呈浅蓝色）。

　　鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。

　　三、鉴定DNA的其他方法

　　用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。

具体鉴定方法如下。

　　1．配制染色剂。

用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭（EB）溶液。

　　2．将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色。

　　3．将蜡纸放在紫外灯（260nm）下照射（暗室中），可见橙红色的萤光（DNA的紫外吸收高峰在280nm处）。

　　四、DNA粗提取与鉴定的另一种方法

　　1．材料用具

　　新鲜菜花（或蒜黄、菠菜）。

　　塑料烧杯，量筒，玻璃棒，尼龙纱布，陶瓷研钵，试管，试管架，试管夹，漏斗，酒精灯，石棉网，三角架，火柴，刀片，天平。

　　研磨液，体积分数为95%的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸馏水。

　　2．方法步骤

　　A．DNA的粗提取

（1）准备材料：

将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，至少24小时。

（2）取材：

称取30g菜花，去梗取花，切碎。

　　（3）研磨：

将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。

　　（4）过滤：

在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液滤入烧杯中（有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000r/min的旋转频率，离心2~5min；取上清液放入烧杯中）。

在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。

　　（5）加冷酒精：

将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的酒精溶液中，并且玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液（玻璃棒不要直插烧杯底部）。

沉淀3~5min后，可见白色的DNA絮状物出现。

用玻璃棒缓缓旋转，絮状物会缠在玻璃棒上。

　　B．DNA的鉴定

（1）配制二苯胺试剂：

取0.1mLB液；滴入到10mLA液中，混匀。

（2）鉴定：

取4mLDNA提取液放入试管中，加入4mL二苯胺试剂，混匀后观察溶液颜色（不变蓝）。

用沸水浴（100℃）加热10min。

在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化（逐渐出现浅蓝色）。

　　附1：

研磨液的配制方法

　　Tris：

10.1g（相对分子质量为121.4），先加50mL蒸馏水溶解，用物质的量浓度为2mol/L的盐酸调至pH＝8.0，再加下述药品。

　　NaCl：

8.76g（相对分子质量58.44）

　　EDTA：

37.2g（相对分子质量372.24）

　　SDS：

20g（相对分子质量288.3）

　　待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定溶至1000mL。

　　若在室温低于20℃时配制药液，SDS呈沉淀析出，此时需要加温，才能将SDS溶解。

如果提前配制的研磨液出现了沉淀，则应加温使沉淀溶解后再使用。

　　附2：

研磨液中几种药品的作用

　　SDS（十二烷基磺酸钠）：

可使蛋白质变性，与DNA分离。

　　EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：

为DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。

　　物质的量浓度为0.15mol/L的氯化钠溶液：

能很好地溶解DNA。

　　Tris/HCl：

提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。

（Tris为三羟甲基氨基甲烷）

　　五、典型例题分析

　　［例1］关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的叙述哪一个是正确的

　　A．随着NaCl溶液浓度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大

　　B．随着NaCl溶液浓度的减小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也减小

　　C．DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关

　　D．当NaCl溶液的浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低

　　分析：

核酸在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度变化而改变的。

在浓NaCl（1~2mol/L）溶液中，DNA的溶解度很大，RNA的溶解度很小，在稀NaCl（0.14mol/L）溶液中，DNA的溶解度很小，RNA溶解度很大，因此，可利用不同浓度NaCl溶液，将DNA和RNA从样品中分别抽提出来。

　　答案：

D

　　［例2］DNA的提取和鉴定实验中，提取鸡血细胞的细胞核物质和析出含DNA的黏稠物这两步中都用到了蒸馏水，其作用分别是

　　A．防止鸡血细胞失水皱缩和稀释NaCl溶液至0.14mol/L

　　B．防止鸡血细胞失水皱缩和溶解DNA

　　C．使鸡血细胞吸水胀破和稀释NaCl溶液至0.14mol/L

　　D．使鸡血细胞吸水胀破和溶解DNA

　　分析：

鸡血细胞在清水中会吸水膨胀而最终胀破，从而释放出核物质。

植物细胞由于有细胞壁的限制，不会因大量吸水而胀破。

DNA在NaCl溶液中的溶解度；是随着NaCl的浓度变化而改变的，在NaCl浓度为0.14mol/L时，其溶解度最小，有利于DNA的析出。

　　答案：

C

　　［例3］在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将提取获得的含DNA的黏稠物（还含有较多杂质）分别处理如下：

　　第一，放入0.14mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得到滤液A和黏稠物a。

　　第二，放入2mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液B和黏稠物b。

　　第三，放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液C和黏稠物c。

　　以上过程获得的滤液和黏稠物中，因含DNA少而可以丢弃的是_____。

　　分析：

在不同浓度的氯化钠溶液中，DNA的溶解度不同。

在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最小；DNA析出，呈丝状物，过滤后存在于黏稠物中；在2mol/L的氯化钠溶液中溶解度最大，所以DNA呈溶解状态，过滤后存在于滤液中；酒精溶液可使DNA分子凝集，因此，在冷却的95%的酒精溶液中DNA凝集，呈丝状物，过滤后，存在于黏稠物中。

　　答案：

A、b、C

　　六、相关高考题回顾

　　（2000年山西高考题）血液中的钙离子在血液凝固过程中起重要作用，缺乏则血液不能凝固，草酸钾溶液能与血液中的钙离子发生反应，形成草酸钙沉淀，起抗凝作用。

请根据提供的实验材料和用具，简要写出第二步以后的实验步骤和实验结果，验证钙离子在血液凝固中的作用，并回答问题。

（一）实验材料和用具

（1）家兔　

（2）生理盐水　（3）酒精棉　（4）适宜浓度的草酸溶液　（5）适宜浓度的氯化钙溶液　（6）试管、注射器（针管、针头）

（二）实验步骤和实验结果

　　第一步：

在A、B试管中分别加入等量的草酸钾溶液和生理盐水（见右图）

　　第二步：

……

　　问题：

设置B管的目的是________。

　　答案：

第二步：

用酒精棉消毒，用注射器取家兔血。

　　第三步：

立即取等量的新鲜血分别加入到A、B两试管中，经过一段时间后；结果：

A管不凝固，B管凝固。

　　第四步：

将等量的CaCl2溶液分别加入到A、B两试管中；结果：

A管凝固，B管仍凝固。

　　问题：

作为A管的对照。

　　●教后分析

　　DNA的制备，关键是对杂质的去除，所以教材中DNA的析出与获取一步中，最好用离心代替沉淀。

　　如果发现获得的DNA量较小的话，可在冰箱中进行的DNA的乙醇沉淀，并且可以将多个小组的产物集中在一个试管中进行鉴定。

　　经乙醇沉淀法得到的DNA沉淀中会混有RNA，建议再用RNaseA处理（具体方法参见相关分子生物学实验指导等）。

　　该实验一课时完成非常紧张，建议实验结束后，安排一节讨论课，一方面分析实验得失的原因和相应的改进方法；另一方面通过相关题例的分析讨论，既巩固DNA的知识结构，又对日后的知识迁移铺平了道路。