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质粒DNA的提取纯化及鉴定
质粒DNA的提取、纯化与鉴定
摘要：
本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5
（E.coliDH5
）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。
同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。
关键词：
碱变法质粒电泳
实验目的：
1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
实验原理：
1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：
提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：
碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：
培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
2.凝胶电泳进行DNA分离纯化：
电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。
各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。
凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。
含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。
利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。
因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨围广。
此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。
需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶。
这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸（5—500bp）的分离和蛋白质电泳。
它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。
虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。
琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。
琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45℃。
琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离围更大（50至百万bp），小片段DNA（50-20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。
在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：
样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。
主要仪器和材料试剂：
1.仪器和材料：
恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。
菌体：
E.coliDH5α受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19。
2.实验试剂：
LB培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭（EB）,DNA相对分子质量标准物DNAMarkerλ/HindⅢ，5mol/LpH5.2的醋酸钠。
实验方法
菌体培养
1
配制40mL液体LB培养基（加入5%葡萄糖）、100mL固体LB培养基、并准备足量的移液管、200μl微量移液器头、1000μl微量移液器头、50mL离心管、1.5mL离心管，灭菌备用。
（1）注意无菌操作
（2）挑了单菌落的接种环要在三角瓶的液避接面处研辗，瞬间可看到菌体进入培养液造成的局部浑浊。
2
向液体LB培养基移取32μl氨苄青霉素，混合均匀。
3
将提前活化的E.coliDH5α受体菌，接种于液体LB培养基中。
将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，37℃，160r/min培养过夜至对数生长晚期。
质粒DNA的提取
1
称量50mL离心管重量W1，取30mL菌液于已称重的50mL离心管中，配平后7000r/min离心5min。
W1=13.46g
2
弃上清，向离心管中加入5mL溶液Ⅰ，涡旋振荡，7000r/min离心5min。
注意溶液Ⅰ要悬滴5次。
3
弃上清并称重W2，求W=W2-W1。
W2=14.47gW=1.01g
4
按照1.0mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅰ，充分涡旋振荡，置于冰面上10min。
加入溶液Ⅰ后,盖好离心管,振荡至液体中无白色菌体丝状物既已振荡均匀。
5
再按照2.0mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅱ，温和颠倒混匀，（置于冰面上10min。
）
（1）可观察到溶液变清亮透明粘稠如蛋清状。
（2）注意加入溶液Ⅱ时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组DNA断裂；静置时间也不能过长，因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂。
6
然后再按照1.5mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，置于冰面上15min。
（1）溶液出现白色絮状沉淀（蛋白质SDS复合物、细胞碎片和其他大分子成分）
（2）冰浴的目的是降低DNA酶的活性,防止质粒DNA被降解。
7
平衡后12000r/min离心15min。
取上清至新50mL离心管，记录体积。
（1）上清液中含大量RNA、断裂的DNA片段和质粒DNA。
（2）此时沉淀不实，宁愿少吸上清，也不要带入沉淀，因为带入的沉淀在之后操作中无法去除。
加入两倍体积的冰乙醇，混匀后在-20℃环境下保存30min。
取出后12000r/min离心15min，弃上清。
加入冰乙醇沉淀DNA。
加入5mL70%乙醇，12000r/min离心5min，弃上清，室温干燥
（1）如果钠盐浓度高，会影响之后的酶切反应等，所以要进行洗涤。
同时，若乙醇浓度过低，则会使DNA溶解损耗。
（2）标记好DNA沉淀位置,以便下一步的溶解。
（3）离心时注意沉淀物位置。
8
取出离心管，加入1mLTE溶液得到粗提物，加入RNaseA液，使溶液浓度为150μg/mL，37℃保存60-120min。
（1）TE溶液的作用：
pH缓冲液，为DNA提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。
同时含有EDTA是二价阳离子的螯合剂，抑制DNA酶作用。
（2）RNase：
去除DNA沉淀中残留的RNA。
质粒DNA的纯化
1
取500μl粗提物于1.5mL离心管中，加入等体积的饱和酚，混匀，7000r/min离心5min,取上层到另一洁净离心管中。
苯酚是强的蛋白阻断剂，可使蛋白变性
2
转移上清（体积V1）至新管，加入等V1的酚：
氯仿：
异戊醇溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层到另一洁净离心管中。
氯仿也是蛋白阻断剂，但强度弱于苯酚，其主要作用是将同水以极小比例互溶的苯酚萃取出来。
如果不加氯仿，残留的苯酚会阻碍酶切反应等，且水饱和酚的密度略轻于水，苯酚相位于上层，不利于获得含质粒的水相，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收
3
转移上清（体积V2）至新管，加入等V2的氯仿：
异戊醇溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层到另一洁净离心管中。
异戊醇可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。
4
转移上清（体积V3）至新管，加入
V3的3MNaAc溶液（pH5.2），再加入2V4（V4=V3+
V3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30min以上，取出后12000r/min离心15min。
收集沉淀DNA。
5
在沉淀中，加入200μl70%乙醇，12000r/min离心1min，可将离心管倒置于纸巾上净上清。
（1）注意不打散沉淀小心倒去上清液。
（2）离心时注意离心管中沉淀物的位置。
（3）尽量用大量程的枪一次吸尽上清。
6
取出离心管，向一只离心管中加入25μlTE溶液，溶解沉淀后，转移入另一只离心管中，再取25μlTE溶液加入第一只离心管中，溶解后再移入另一只离心管中，得到50μl纯化质粒DNA。
注意小心温和振荡。
DNA纯度检测
1
取40mLTAE（1×）于300mL锥形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微波炉使其熔化，60℃时倒入准备好的制胶槽中。
制胶时，胶液温度过高，会使模具变性，影响胶孔大小和胶形状，从而间接影响加样量和跑条带。
胶液温度过低，会凝固，所以在胶液冷却至50~60℃左右倒胶。
2
取5.0μl纯化DNA加入1.0μl上样缓冲液，混合，进行点样。
注意加样时枪尖应恰好置于液面下凝胶点样孔上方，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。
3
点样完毕后，100V，200mA条件下电泳30min。
4
电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。
溴化乙锭是一种强致突变剂，应严格戴手套操作！
注意事项
1）扩大培养菌体时，挑了单菌落的接种环要在三角瓶的液避接面处研辗，瞬间可看到菌体进入培养液造成的局部浑浊。
2）沉淀菌体的量不要贪多，适宜即可，菌体过多，可能会导致溶液Ⅰ无法混匀，细胞裂解不充分。
3）加入溶液Ⅰ重悬要充分，如果细胞没有完全散开悬浮，将会影响溶液Ⅱ裂解细胞，最终导致提取产物中含较多的蛋白质，染色体DNA等杂质。
4）加入溶液Ⅱ时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组DNA断裂；静置时间也不能过长，因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂。
5）使用离心机时，样品放置要对称平衡，否则会严重损害离心机的使用寿命。
6）制胶时，胶液温度过高，会使模具变性，影响胶孔大小和胶形状，从而间接影响加样量和跑条带。
胶液温度过低，会凝固，所以在胶液冷却至50~60℃左右倒胶。
7）注意加样时枪尖应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。
跑多个样时，应依次快速点样，否则时间一久，样品会弥散掉！
8）DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，点样孔在负极。
注意使电泳槽中缓冲液没过琼脂糖凝胶2mm为宜。
9）EB是一种强致突变剂，应严格戴手套操作！
实验结果
凝胶电泳拍照结果
Ⅱ
Ⅲ
图质粒DNA纯度检测凝胶成像结果
标注：
1号泳道：
λDNAmarker/HindⅢ
2号泳道：
线性的pUC19质粒DNA
3号泳道：
超螺旋状态的pUC19质粒DNA
4至15泳道：
1至12组的pUC19质粒DNA
16泳道：
加葡萄糖培养的线性的pUC19质粒DNA
17泳道：
隔夜菌株培养的线性的pUC19质粒DNA
18号泳道：
未加RNaseA的线性的pUC19质粒DNA
Ⅰ以上带是λDNA出现处
Ⅱ以上带是线性的pUC19质粒DNA出现处
Ⅲ处是RNA出现处
Ⅳ处是点样槽，其中的光斑则是代表蛋白质
各带光斑由上向下分别代表的分子量由大到小，各光斑的亮度则表示该物质含量的高低，越亮则代表浓度越高
分析
理论上碱变法提取质粒DNA琼脂糖凝胶电泳可能出现条带情况如下（按离点样孔远近排序,即电泳速度快慢排序）：
1.RNA：
没有完全裂解除去的RNA浅条带；观察Ⅲ处各组均有RNA残留,但是俩都不是很多。
2.cccDNA：
共价闭合环状质粒DNA,即所要提取的pUC19质粒超螺旋结构；观察Ⅱ区域各组条带亮度相差不多,因此产量相近,只有9号条带几乎观察不到,对于九号后面会有专门的分析。
各组也均有拖带的现象,但都不是很明显。
对于我们组8号,个人还是比较满意,毕竟第一次做,个人观察产量估计是180ng/ml。
3.ocDNA:
质粒的一条链断裂，超螺旋松弛开环结构。
4.LDNA:
DNA复制中间体，即没有复制完全的两个质粒连在了一起。
经典的实验教材一般认为这条带是线性结构质粒，实际上,这是一种误解。
正常情况下,碱法提取的质粒很少有线性的,电泳一般不出现。
经验也提示,只有一个酶切位点的切酶切割质粒时,结果总是只有一条电泳条带。
如果有线性结构质粒,则不可能出现这种结果。
因为如果有线性质粒的话,单一酶切不可能出现单一条带。
5.染色体DNA:
如果在加入溶液Ⅱ后过渡振荡，会产生这条带，该带泳动得较慢，是20—100Kb的大肠杆菌基因组DNA片段,即Ⅰ线上方区域,观察各组条带均有白色暗斑,相对来说我感觉我们组的8号带还是比较好的,而5、7、16号就比较明显了。
6.如在点样孔附近出现荧光，则说明提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质，阻碍了部分DNA泳动，形成荧光。
观察各组的点样孔Ⅳ，5、7、11、12、14、16号带白色较明显,很可能是蛋白质去除不彻底,也可能是点样时戳破了点样孔。
我组是8号,相对来说比较好,蛋白质去除比较干净。
7.第九组没有提取出pUC19的可能性分析：
（1）有的组得出了很好的结果，作为对照，排出了菌体或实验方法本身等源头出现问题，只能是自己实验操作出了问题；
（2）电泳图谱显示出了RNA浅条带，又RNA一直和质粒DNA处于同一相，所以不可能是将提取的质粒误丢；
（3）两次电泳结果都一样，排除点样跑胶问题；
（4）整个提取质粒过程应该没有问题。
因为，从实际现象上看，得到的DNA粗沉淀为乳白色，其颜色和量都正常。
从理论上分析，即使是加溶液Ⅰ没有充分悬浮，或者是加溶液Ⅱ和Ⅲ时震荡过于激烈，那产物中也应该会有质粒DNA，只是带有较多蛋白质，染色体DNA等杂质；
（5）最大的可能性是最后一步加1/10V3mol/LNaAc（pH5.2）和2V冰乙醇沉淀纯化后的DNA出了问题，因为上清液不是按既定量程一次性吸取出来的，当时操作人也不清楚第二次吸取的上清体积，所以就大约估计为350ul。
可能是体积估计误差较大，所以加入NaAc和冰乙醇后，Na+和乙醇浓度都没有达到沉淀DNA的标准，DNA没有被沉淀！
讨论
1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。
皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。
2.本次实验中，原应灭菌之前加入培养基的葡萄糖由于操作疏忽而忘记加入，随后按照老师指示配制100mL10%的葡萄糖溶液一起灭菌，待灭菌后再将葡萄糖溶液加入培养基中。
3.为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部，再用移液器移除液体。
4.为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。
在整个质粒提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。
加入溶液Ⅰ时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。
加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。
因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。
5.在纯化DNA加入冰乙醇的步骤中，2只离心管在加入的DNA样品量相同的情况下，出现了从-20℃环境下取出后2只离心管液体体积相差较多的情况，分析后发现量较少的1只离心管加入的各种试剂的量是合适的。
可能的原因：
①在用移液器移取冰乙醇时下按力度太大，吸入过多液体；②2只离心管分别由2名组员加液，操作上可能出现个人之间的误差。
6.本次实验得到的质粒DNA较少，最主要原因是选择了菌体生长较少的培养基，仅得到较少的粗提物，导致最终纯化得到的质粒DNA也较少。
附注：
培养基及实验试剂配方：
1.LB（LuriaBroth）培养基
LB液体培养基：
1%蛋白胨（typtone），0.5%酵母粉（yeastextract），1%NaCl。
用NaOH调pH至7.2,121℃灭菌20min备用。
LB固体培养基：
除以上LB培养基成分外，还需要添加1.5%~2%琼脂，121℃灭菌20min备用。
LB半固体培养基：
在LB液体培养基中加入0.75%琼脂，121℃灭菌20min备用。
2.氨苄青霉素：
母液浓度为100μg/μl，工作浓度为50~100μg/mL。
3.TE缓冲液：
10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA。
4.氯仿/异戊醇混合液：
按氯仿：
异戊醇为24：
1（V/V）的比例在氯仿中加入异戊醇。
5.酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液：
饱和酚：
分析纯的酚溶化后经160℃重蒸后，加入0.1%（V/V）的抗氧化8-羟基喹啉，再加入等体积的0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液反复抽提，使之饱和，并使其pH为8.0，亦可购买商品化的饱和酚。
按酚与氯仿/异戊醇为1：
1的比例混合饱和酚与氯仿/异戊醇混合液，即得酚/氯仿/异戊醇（PCI）（25:
24:
1）混合液。
6.6×上样缓冲液：
30%甘油，0.25%溴酚蓝（bromophenolblue,BPB），0.25%二甲苯氰FF。
7.溶液Ⅰ：
50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA。
8.溶液Ⅱ：
0.2mol/LNaOH，1%SDS（临用前用10mol/LNaOH和20%SDS母液配制）。
9.溶液Ⅲ：
5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，重蒸水28.5mL；溶液终浓度为：
K+3mol/L，Ac-5mol/L；
10.RNaseA母液：
将RNaseA溶于含10mmol/LTris-HCl（pH7.5）和15mmol/LNaCl的溶液中，配成10mg/mL溶液，于100℃加热15min，使污染的DNase失活。
冷却后用1.5mL无菌离心管分装，保存于-20℃。
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