转基因小鼠制备实验方法.docx
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转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法
1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:
00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10IU）。
2、47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:
00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:
30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5%CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5%CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。
将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。
将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。
手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。
（一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。
用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。
）
第二节 转基因小鼠的制备
在研究心血管疾病时，主要运用显微注射法、基因打靶或基因剔除等方法制备各
TGM模型
1．显微注射法
Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有
种外源DNA顺序的TGM。
1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”（supermouse）曾引起整
生物学界的轰动。
这
方法外源DNA整合率高、容量
，DNA长到50kb仍然有效，实验周期缩短，因而应用较广泛，是制备TGM的一种常用方法。
这一方法的实验程序如下：
⑴准备假孕母鼠（养母）：
将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作
受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：
可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（HCG）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：
用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：
将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：
①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。
也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。
表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）或放射免疫测定（RIA）等。
亦可取胚胎进行分析。
显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。
我国已有少
实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白TGM研究。
图23-2显微注射法制备转基因小鼠的程序
2．基因打靶与基因剔除技术
ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的内胚团（inner,cellmass）中分离出来的。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。
这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。
正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。
基因打靶是指外源DNA片段上带有与受体细胞染色体相应部位的同源序列，导入ES细胞后在同源部位发生定点整合，这种整合是通过同源重组的方式来实现的。
Piedrahita等（1992）应用此技术已成功地筛选出携带突变ApoE基因杂交鼠后代。
该方法的一般策略如下：
如果外源DNA含有突变失活的基因，定点整合人ES细胞染色体后取代原来的同源序列，即是基因剔除。
将这样的ES细胞转入小鼠胚胎，便可得到基因剔除的基因小鼠。
采用突变基因（mutatedgene）剔除正常基因以产生定位突变（targetmutation）。
即首先选定需要突变基因的全部或部分DNA序列，通过插入、修饰、删除或置换等手段落使其突变，成为靶载体，将靶载体导入小鼠ES细胞中，使之与细胞染色体内同源的靶序列进行重组，达到定位突变细胞内该基因的目的。
然后在细胞水平和分子水平筛选富集发生突变细胞，并注射到小鼠囊胚腔内，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中，所产生的子代雄性嵌合鼠与正常雌鼠交配可获得生殖系携带该突变基因的纯合鼠。
最后对纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产生等进行分析。
目
筛选真正发生了同源重组的ES细胞的方案有数种，如正负双向选择法（positiveandnegativeselection,PNS）、标记基因的特异位点表达法及PCR法，其中用得最多的方法首推PNS法。
其基本原理是：
构建含有一段与靶基因同源序列（10～15kb）的载体，该序列的一个外显子插有neor基因作为正选择的标志，在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因作为负选择，HSV-tk基因由邻近的neor基因启动子调节。
用电转移（electroporation）法将重组体导入ES细胞，继续作体外培养，并以新霉素（G418）和致死核苷类似物（GANC）作双重筛选。
因随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体细胞DNA中，HSV-tk+基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡。
如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neor基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗G418有正选择作用，对GANC无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的（图23-3）。
Plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺ApoE基因的TGM模型，并利用这一AS小鼠模型研究了饮食和遗传因素对AS的影响。
图23-3正负双向选择法示意图
a：
同源重组；b：
随机整合；neor：
新霉素抗性基因；HSV-tkc：
疱
疹病毒胸苷激酶基因；GeneX：
干细胞内源基因（与导入基因同源）；
G418：
新霉素；GANC：
抗致死的核苷类似物GANC；GANC：
核苷类似
物参与合成，细胞致死。
近几来，随着对基因失活方面研究的深入，引发了基因剔除技术的一大飞跃，产生了条件性基因剔除（conditionalgeneknockout）。
条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。
目前多采用Cre-loxP重组系统（Cre-loxP-mediatedgenereplacement,Cre-loxPrecombinationsystem）。
其中Cre重组酶来源于侵染大肠杆菌P1噬菌体。
分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动DNA分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxP的特异位点（loxpsite），且不需要其他的蛋白质因子。
在Cre酶存在时，两个loxP位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxP位点。
其原理如图23-4所示。
研究发现，在哺乳动物细胞中Cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。
图23-4Cre酶作用原理
1Cre基因转译成Cre酶；2Cre酶作用于基因组上loxP位点；3Cre酶使两个loxP位点联合；4两个loxP位点发生同源重组切除X基因及一个loxP位点而仅留下一个loxP位点。
Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：
①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至内源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因HSV-tk及neor、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。
在此新构建的NDA序列中，在可选择性标记基因和正常基因片段的两侧都连有loxP位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码Cre重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxP位点之间的HSV-tk、neor及正常的野生型基因均在Cre酶的作用下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxP位点，其Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除程序如图23-5所示。
条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的
加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破，将给动脉粥样硬化的研究增加更便利的条件。
图23-5CreloxP重组系统进行条件性基因剔除程序
1有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；2将一个loxP位点插在野生型基因片段的3’端；3将新构建的DNA序列整合到基因组上；4在Cre酶的作用下切除HSV-tk、neor野生型基因及一个loxP位点；5经过Cre-loxP重组系统作用后所形成的DNA序列。
广义的转基因动物是指通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。
转基因动物可通过插入目的基因用于过表达基因研究，或是通过插入目的基因的shRNA来降低目的基因的本底表达，也可通过同源重组的方法获得基因Knock-in和Knock-out小鼠。
小鼠作为最优秀的实验动物模型，在转基因动物研究领域也同样得到了广泛验证。
转基因小鼠的制备技术主要有两类，DNA原核显微注射法和胚胎干细胞囊胚显微注射法。
DNA原核显微注射法
通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。
此方法是最经典的用于制作转基因动物的方法，也是目前应用最广泛的方法，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。
由这种方法制备的动物品种属于狭义的转基因动物的范畴。
由这种方法制备的转基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷贝首尾相连的形式，其整合到基因组的具体机制目前并没有完全研究清楚。
胚胎干细胞囊胚显微注射法
是在体外将外源基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞通过显微操作仪注入动物囊胚，此胚胎干细胞可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。
胚胎干细胞体外培养时保持未分化状态，当被注入囊胚腔后，可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可实现基因的转移。
出生的动物其生殖系统就可能整合上外源基因，通过杂交繁育可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。
目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。
基因的敲除及捕获常用这类方法。
注：
转基因小鼠制备技术路线，此图片由赛业（广州）生物科技有限公司提供
显微操作技术（MicromanipulationTechnique）是指在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器（Micromanipulator），控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。
操作方法
目前，以细胞内微注射和微灌注技术为基础的玻璃针头（GlassNeedle，精细的玻璃微量毛细移液管）的使用，已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项非常普遍的操作方法，比如在体外受精、转基因中等等。
描述这些技术最恰当的话应当称其为---显微操作，因为这些操作是通过单个的或多个的筒状玻璃微量移液管、精确的定位装置（显微操作器）以及微量注射器或微量灌注器来在单个的细胞上进行的。
显微技术的分类
显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等，例如多莉羊就是运用细胞核移植技术而成功的；而转基因技术指的是将外源基因导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物的生殖细胞染色体中的一门技术，基因转殖动物被定义为由人为的方式将外源基因引入体内而引起基因改变的动物，并可将遗传特质传递到接续的每一世代中。
概述
微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。
这些可以注射进细胞的物质包括有：
各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。
运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。
转基因动物的制作，可以利用基因微注射（genemicroinjection）、胚干细胞（embryonicstemcells,EScells）、精子载体（spermvector）、反转录病毒感染（retroviralvectorinfection）及体细胞核移置（somaticcellnucleartransfer）等方法达成，其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。
显微注射
显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组（rearrangement）、缺失（deletion）、复制（duplication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。
这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操作设备，制造长管尖时，需用微量吸管拉长器（micropipettepuller），注射时需有固定管尖位置的微量操作器。
这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。
此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。
显微注射的优缺点
以显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。
其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。
这些操作中所使用的微量移液管是用毛细管拉针器（pipettepuller）来制作的，先将玻璃毛细管加热到其熔化的温度，再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形，微量移液管小头的直径（小至0.2微米）与纤维操纵器的高精度相关，它可以用于精准的移液。
这种精确度可以为各种类型和任意大小的细胞提供亚皮克升级或0.1微米（micron）范围内的精确的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。
通过运用直接的水压（压力注射）或者不通过使用水流，而通过施加一电场来使带电离子运动（离子电渗法），都可以获得将微量移液管中的物质挤喷出去的效果。
常用生产转基因动物的方式
目前最常用来生产转基因动物的方式为：
直接把重组过的DNA注入受精卵的原核（pronuleus）中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管（holdingpipette）固定住，之后注射针则依序穿过zonapellucida，ocytemembrane及malepronuleusmembrane后，将DNA注入，注入时可以见到原核膨大。
以小鼠受精卵雄原核的显微注射为例，显微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射针（injectionneedle）制备很困难，除影响操作时间外，也是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。
固定吸管之内、外径分别为30、80μm是较为合适的，显微注射针自针尖起20μm处的外径为4μm时，可获得良好的转染效率。
固定吸管的内径如果太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易；如太大，则受精卵易受伤害，影响胚胎的存活率。
显微注射针尖如果太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。
因此进行受精卵雄原核的显微注射时，如何制备适用固定受精卵的吸管及显微注射针是关乎转基因效率极其重要的因素。
显微注射实验操作
（1）导入DNA的制备：
显微注射首先涉及导入DNA的制备，显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA，转基因所用载体是真核表达载体，即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。
所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。
制备转基因小鼠，必须对待导入DNA进行分离纯化。
实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA，对导入基因的大小没有特别的限制，长链DNA也可成功。
实验中注意防止一些杂质堵塞注射针，如琼脂糖颗粒、纤维物质等，需尽量超速离心除去。
DNA的注射质量是实验成功的关键。
研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml，当DNA注射浓度超过一定上限时，实验效果不佳，而且大于5ng/ml会产生明显的毒性作用。
导入DNA的制备程序如下：
1）通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。
2）为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏，用长波紫外光显影。
3）切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。
4）乙醇沉淀目的DNA。
在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。
5）-200C孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。
6）用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。
7）按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。
清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。
8）注射缓冲液（10mmol/LTris-HCl/0.1mmol/LEDTA,pH7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制
9）通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度
10）用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/?
l.
（2）器械准备
[注射针的制作]
注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。
用拉针仪（SUTTER,P2000laserbasedmicropipettepuller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。
必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。
一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。
另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度（主拉力和次拉力）将处于最佳状态。
具体需要预实验来确定其最佳设置。
待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。
严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用NarishigeJapanmodelPN-30。
[持卵管制作]
为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。
这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。
持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。
具体制备操作：
双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。
用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐（如不平齐，应重新切割）。
然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理（即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意）。
如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。
持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度（不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度）轻微弯曲以方便使用。
此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140?
m。
持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50?
m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。
为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。
[洗卵管制作]
1）点燃酒精灯，调节火焰到最佳。
捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。
2）当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200?
l的吸管。
注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。
3）为吸管评分，轻柔地折断吸管，辨别其声音是否清脆，或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。
4）解剖镜下（要在熔断仪上）检查吸管，并对其进行调整，确定其口径以及管口光滑平整。
[移卵管的制作]
用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。
不同的是，这些吸管的口径稍微小一些，大约150?
m（150-160?
m），直径比单受精卵的口径略大一些，将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。
移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤，同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。
管口要平且要钝化。
[凹玻片的准备]
必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培养皿做注射槽，载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。
具体凹玻片的准备程序如下：
1）在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液体的折射效应。
吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上，矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜，将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上，在低倍镜下调节焦距，使M2溶液液滴的底面清楚为止。
2）覆盖矿物油的作用：
防止液滴脱水以及浓缩；使受精卵处于无菌状态；
固定M2溶液液滴。
3）从孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次，调整实验用量，将其置
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