荧光PCR定量质量控制及防污染措施.docx

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荧光PCR定量质量控制及防污染措施

解放军第三0二医院王海滨

写在课前的话

近几年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越广泛。

但是如何进行治疗控制以及出现污染后怎样进行清除污染？

本文主要讲述怎样来防止污染的产生。

一、荧光PCR定量的概述

（一） 荧光PCR定量的原理

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

常规的PCR也就是电泳PCR，它是合成一个正向引物和反向引物为目的模板，即DNA或RNA作为一个模板扩增，扩增后通过跑电泳的方式来检测它存在与否，是相对量的变化。

由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的几率比较高。

近几年PCR扩增时在参入一对引物的同时参入单个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'端～3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有单个荧光分子构成，实现了荧光信号的累积与PCR产物构成完全同步。

通过荧光物质参入和TapMan探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增到检测都在一个封闭的状态。

荧光集团目前临床常用的有两个，一个是SYBRgreen，一个是TapMan探针。

SYBRgreen是一类荧光染料，能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。

变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。

在扩增的过程中由变性到负性扩出了另一条链和模板DNA进行退火变成双链。

这时SYBRgreen染料与DNA双链结合,发出荧光信号。

用SYBRgreen荧光染料来作为指示剂时，中间要加一个溶解曲线来证实它的特异性的问题。

另一个是TapMan探针，在两个引物中间设置一条特异性的探针，它标记有荧光染料通过激发和检测的过程来检测特异性扩增模板的存在。

（二）PCR原理图

（三）定量原理

定量原理：

初始模板量的对数与C（T）循环数之间的线性关系。

初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少。

域值～Ct值，荧光曲线由潜伏期进入对数期的拐点。

Log浓度与循环数呈线性关系（如图二），根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量

图一为PCR扩增曲线 

图二为：

标准曲线

（四）TaqMan探针法

TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3p→5p外切核酸酶活性，切断探针产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。

探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间.探针的5p端标记有报告基团（Reporter，R），如FAM、VIC等，3p端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q），如TAMRA等。

当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。

随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3p→5p外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收，即产生荧光信号。

所以,每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

信号的强度代表了模板DNA的拷贝数。

二、质量指标

荧光PCR质量控制。

一个好的结果必须有一个好的试剂，有合格的操作人员，有合格的环境等因素。

（一）特异性

首先一个好的试剂要有特异性。

现在临床检验用的试剂，都是要求国家药监局所批的试剂，因此它序列的特异性都是通过专家所认证的。

但是用SYBRgreen染料进行定量时，要注意在放射学应用之前或在确定放射学是不是可用时，要通过溶解曲线来对这个方法做一个特异性的评价。

另外要注意交叉性的问题，特别是做细菌16sRNA的检测，试剂制备是在国家严格要求的GMP厂房里生产。

试剂出厂后运输到检测单位，他们使用的环境基本上不具备GMP厂房的条件。

因此如果检测的试剂要求比较高，在GMP厂房或在一个标准的PCR实验室里面才能做的比较合格，而在一个现有的实验室，虽然通过验收但是环境要比GMP厂房要求的环境差，所以两个应该有同步性。

就是说在GMP厂房好的条件下生产的试剂，放到现有的实验室里面也应该得到同样一个实验结果。

如果我们现在的实验条件出现了交叉性的污染问题，即我们环境里面就存在一个16sRNA这样的菌株，那我们现有的检测结果就没有可靠性。

（二）敏感性

一个好的试剂要有好的敏感性。

有的专家想通过增加模块扩增的量来提高敏感性，我们认为是不科学的，从低碳的境地来讲也是不科学的。

目前我们所做的实验，加入模板的量是微量的，有的是3ul，有的是5ul，最多的是10ul。

常规的应用PCR反应体系一般是30～50ul。

一些进口的试剂用了100ul，这样成本实际价格也非常高。

我们现在30～50ul的反应体系下，一般模板的量在5～10ul就足够。

如果从5～10ul变成了10～20ul，虽然可以提高1倍的敏感性。

但是里面的干扰物质会相应的增加，影响结果的准确性。

（1）扩增效率

试剂本身的扩增效率应该是最佳的扩增效率，对检测模板所设定的引物和探针的位置不唯一，它有好多位置，好多序列都可以设计。

但是在不同的区域设计的不同引物和探针，它扩增的效率可能有很大的差别。

对于一个势力雄厚或有经验的实体公司常常是设计很多条引物和探针，并且精确到个别碱基，然后通过理论、软件，更重要要通过实践的筛选，筛选出活性效率比较最高的一套引物和探针来制作试剂。

在整个PCR扩增反应的效率和敏感性上，我们把它比喻成是跑步和跳高的关系。

如图三所示。

这是典型的一个PCR扩增实时荧光曲线，扩了45个循环。

我们可以看到从扩增的初期在没有荧光信号的情况下逐渐扩增，扩增到12个循环后检测到了阳性的扩增信号，这个信号越来越放大，然后在10个信号左右达到平台期。

这条蓝线是基线即为CT值，从第一个循环到第十二循环没有跑步，十二个循环之后开始跑，跑到最近也是最快的量是最大的。

再上后整个模板里，含量最低的在最后，也达到了极限，这就是跑步。

跳高就是达到平台，量最大的标本，这个反应孔达到一个高平台，量最少的反应孔也应该达到与量最大的同样一个平台度，这就是跳高。

不管原始模板量高中或低，一个好的试剂应该以同样的比例和速率往前移，移到最快，即跑的最快同时跳的最高。

最后含量最低的这个反应孔也要跳到同样的高度，这是一个好试剂的标准。

曾经对国内的试剂进行一个考核比较，发现同样一个高中低的模板，按照理论扩增时，有的试剂扩增效率开始跳的还很高，后来越跳越矮，这个实体生产厂家在探针设计合成或它的质量、比例、数量等有问题，Taq酶的活性也非常重要。

图三：

AmplificationPlots

（2） 添加剂

添加剂，目前为了防止扩增污染的，好多试剂公司，包括卫生临检中心也要求，在实验的反应体系要加入一些UNG酶，UNG酶可以有效的防污染，但是UNG酶在防污染的同时在95℃3～5分钟要对它进行灭活，否则它会影响以后的扩增。

95℃3～5分钟能不能把UNG酶灭活？

后来我们做了一些实验发现95℃5分钟很难彻底的把UNG酶灭活，因此它的存在对试剂的敏感性产生了影响，特别是对低拷贝反应孔的扩增产生抑制的作用。

另外关于内标的问题，一个好的实验结果，最重要的体现在重复性上，虽然敏感性越高越好，但是更重要的还是重复性，临床医生更注重同一个标本在不同次检测应该获得同样一个值，虽然在基因检测里不可能达到完全相同，但至少要在一个范围之内。

（三）重复性

影响重复性的因素有很多。

第一，仪器间的差异，能够拿到临床应用的这些仪器间的差异不是特别大，但是在仪器使用过程中会有好多影响因素。

仪器使用不当、电压不稳或维护不当常常导致不同台仪器的差异比较大。

仪器的厂家要及时对仪器进行维护、保养。

第二，辅助仪器，离心机、移液器等，对于微量的实验比较重要。

对于需要离心、沉淀或提纯的实验，离心机的转速和定位时间要准，离心机的校准也非常重要。

第三，实验室的环境，包括空间环境和结构环境，为了防止污染尽可能要做一个物理的分割，也就是核酸的提取、扩增和试剂配制要通过物理分割的方式分开。

第四，实验室的温度，用Trizol试剂来沉淀或提取RNA，如果冬天外界温度比较低，Trizol就会结晶、沉淀，它裂解病毒的效率就要明显的低下，这时经常出现假阴性。

第五，操作人员是非常重要的一个因素，不同单位很难进行规范统一的一个方面，就是操作人员的专业素质问题。

如图四所示跳的高度都不一样，如果把基线放到不同的位置，结果就不一样，因为有些地方出现交叉。

这虽然是不同的反应孔，单孔来看还是一个典型的S型曲线。

但是荧光PCR定量时4个标准品或者3个标准品，它是同时形成一个标准曲线，生成一个定量的尺度范围，然后来定量，因此我们更强调不同的反应孔放在一块儿进行分析，要求不同的反应孔之间都是平行的，也就是说最后应该是同样的一个效率。

图四为：

PCR扩增曲线 

三、质量环节

（一）核酸提取方法（核酸丢失）的影响

不同单位用购买的试剂盒进行操作的过程中，即核酸提取的过程，是影响质量的一个重要的原因。

对荧光定量来说，标本里的核酸量的变化应该是唯一量的变化，相应的其他过程不应该有量的变化，这才是一个标准。

 PEG6000、蔗糖～T等浓缩法：

变量多如离心速度及时间、去上清、裂解液加入量、混匀程度差异等均导致核酸丢失。

如果除了需要检测的模板量变，在我们使用过程中又导致了检测的物质里的量发生变化，定量的结果会受到很大的影响。

核酸提取的方法有好多，目前最常用的是热裂解的方法。

丙肝病毒或甲流H1N1的检测常用层析柱，还有目前越来越流行用磁珠的方法被动吸附。

TRIZOL的方法逐渐被淘汰，因为一是它有毒，二是它丢失的核酸比较多。

近几年又出现血清直接加入法（核酸释放剂），目前主要是有四种：

第一是聚乙二醇，即热裂解法；第二是层析柱的方法；第三是磁珠提纯法；第四是TRIZOL沉淀提纯法；第五是血清直接加入法（核酸释放剂），这些方法除了第五种没有丢失，但第五种存在把血清加进去是不是有干扰物质的问题，前四种都有核酸的丢失。

（二）PEG提取法核酸丢失情况

我们对PEG提取法核酸丢失情况做了一些实验，它的做法是先用100ul裂解液A和100ul的血清混匀，然后高速离心，把上清液去掉，去掉的上清液是不是还有病毒？

然后把去掉的上清液再做同样的过程，发现上清液不但有丢失，而且丢失的很多。

如图五所示，2×108 ，4×106 、1×105 、1×103 ，四个不同浓度的血清通过PEG提取法的方法,把离心之后去掉的上清液再做一个提取，结果发现红色是上清液检测的量，蓝色是原液，相应的丢失率分别为5.8%、24.8%、16.0%、16.7%。

图五为PEG提取法核酸丢失情况

上清去掉后对沉淀的物质加入碱性裂解液进行吹打混匀然后煮沸再离心。

试剂盒的要求是振荡混匀，但是把吹打混匀和振荡混匀的结果进行对比，如图六左所示：

蓝柱是吹打混匀，红柱是振荡混匀。

吹打混匀得到的量相对要高一些，可见先吹打再煮沸比简单的震荡混匀要充分的多。

因为振荡不能将沉淀的颗粒完全振开，自然裂解就不充分。

因此，上清液的丢失，和沉淀颗粒的混匀方式对结果影响还是比较大的，从图上可以看到对于第次方的丢失率甚至可达百分之百。

图六为吹打混匀和震荡混匀的比较

（三）层析柱核酸丢失情况

下面对HCVRNA核酸提取常用的层析柱方法，进行研究发现有两个丢失的步骤。

一，标本通过胍盐裂解后要过层析柱，过层析柱后滤下来的部分液体，里面是否有核酸？

我们做了连续4次的过滤，滤下来第一滤拿出来，再滤第二滤，共做四次，然后再分别定量，结果如图七所示。

滤液一为1.32×106 ，滤液二为3.95×105 ，滤液三1×105，滤液四为1×64 。

因此可以看出过滤过程核酸的丢失程度还是非常严重的。

滤完后层析柱通过洗涤液A、洗涤液B进行离心、洗涤，洗涤过程的丢失这里先不考虑。

单看最后一步洗脱过程，此处要加50ul洗脱液对层析膜上的核酸进行洗脱。

第一次加50ul离心洗脱的部分为第一份。

然后再加50ul洗出第二份，依次连续洗四次。

最后得出的数据和刚才的基本一致，也有接近20%～50%的丢失。

图七为 层析柱核酸丢失情况

如果将两次的丢失叠加，就有近乎80%～100%的丢失，当然中间还有两次洗涤还没计算在内。

由此可见层析柱的方法核酸的丢失是非常明显的，丢失率为一倍以上。

如果标本和标准品的提取是同步进行的，那么这种定量的结果还是具有可比性的。

但现在的试剂盒中标准品往往是不参与提取的，也就是标准品不丢失，而标本却丢失严重的，这时要注意，如果标准品是通过WHO定标的标准品，那么检测到的实际值应该是偏低的。

四）其他影响因素

当然对实验结果的影响还有包括仪器的差异，不同采光的原理、光源的强度。

这里要强调光源的强度，因为荧光PCR仪器是通过光源照射以后来激发检测的，那么该光源是有一定寿命的，如果光源使用时间比较长，光亮度不够，那么检测的信号也相应会比较弱一些。

这对实验的结果，特别是对弱阳性的结果影响会比较大。

最后还有专业人员操作的一个差异也会对结果造成影响。

因此对结果的影响因素，除了试剂盒的质量以外，实验室的环境、操作人员的素质，包括试剂操作方法的差异，都是影响实验结果的重要因素。

特别是不同的提取方法，如聚乙二醇法、层析柱法和没有提到的磁珠法，同样存在因被动吸附引起的丢失的问题。

而这些都会影响到整个实验的均一性。

哪些因素影响PCR荧光定量的实验结果？

四、污染与防污染措施

大家也许知道1998年时PCR检测技术在国内基本上是停用的，主要原因是当时在国内用的比较乱，有些乡镇医院也做PCR检测，也可以有一个跑电泳的房间，通过电泳结果来出临床报告。

当时很多实验室做什么试验都是阳性的，也就是说当时的污染非常严重。

因此98年停用以后经过几年的整顿，卫生部要进行严格的PCR实验室验收，同时进行人员培训以及对试剂逐渐过渡到荧光PCR，通过一个闭管检测的方式，大大减少了污染。

但是目前污染还是存在，主要原因是核酸提取还是开放性的，同时产物的处理还不严格。

更重要的是试剂盒里面的标准品都是阳性的模板，有的是质粒，有的是合成的序列，有的是血清，不管是怎样都是阳性的物质，因此常常也是污染的重要来源。

目前实验室防污染主要是，一防止核酸提取过程的外泄；二在试剂配制的过程中防止标准品的污染；三要防止产物的外泄。

实验室要严格的分区管理，就是物理隔离，核酸提取和试剂配制不能在一起，试剂配制要尽可能在核酸提取的前方。

人员和用的物品要完全不同，就是不要把核酸提取的物品带到试剂配制室里去。

要通过严格的分区，工作服和使用器具的更换来达到相互不污染的目的。

其次，要严格的实验室通风，一定要有对流风。

有的实验室为了达到这个通风，可以安装排风扇。

实验室的通风是防污染的非常重要的方法。

不要指望把污染物质给清掉，而是应该把它污染从实验室赶走。

通过通风的方式把实验室里面的污染物质带走这是最有效的方法。

实验室设计，最早的实验室设计是一个闭风的状态，现在都变成了一种通风的状态。

另外，有效的消毒对防污染也有作用，不管是提取的核酸还是扩增的产物。

包括84消毒液，健之素等，都可以对序列起到破链的作用。

对实验室的操作台和其他物品，只要是不怕水，耐腐蚀都要通过有效氯消毒液进行浸泡、擦拭最后清水洗净的方法来清洁。

通过一些实验室也发现酒精擦拭或通过高压处理的方式都达不到清除污染的一个目的。

因为高压只能把活的东西压死，对细菌灭菌是有效的，但对序列就很难破链。

紫外线照射也是如此，虽然对产物有一定的破链作用，但是对提取的核酸大片断的破链效果还是较差的。

最后，人员培训也非常重要，对于以前没有这方面意识的人员的培训必不可少。

不具备防污染意识的人员尽可能不要操作实验。

产生污染的原因有哪些？

如何防止污染的产生？

五、关于内标的讨论

（一）实时荧光定量PCR无需内标

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

（1）Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

（2）Ct值与起始模板的线性关系

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。

（二）内标对实时荧光定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。

但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。

正因如此，定量方法虽然加入内标，仍为一种半定量方法。

美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：

内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。

AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。

（三）内标的失败率

我们对采用3家公司考核试剂内标失败率进行分析，3家试剂的内标均存在内标失败的情况，但各不相同，阳性标本的失败率在3.2%～16.5%；阴性样本的内标失败率在4%～7.2%，高于COBAS的失败率（1.7%，1/60）。

掺入内标的量大多为5×103 左右，我们采用PEG和直接加入两种方法对2×103 的HBV阳性血清进行96孔重复核酸提取，失败率均为0。

内标现在有两类，一类是内标定量，罗氏COBAS®TaqMan®就是内标定量，在每管里都有一个内标，该内标是一定量的，它来做为一个定量点，标本扩增曲线的Ct值和内标按照3.3的一个比例关系来进行内标定量。

另一类是提取内标，国内现有的内标都不是定量内标，而是提取的内标，也就是在提取的过程中加入一个定量的内标和要提取的标本同时进行提取。

对内标的要求本应是核酸的模板是多少量，内标应该也加多少，做到公平竞争。

而实际上要测的模板的量未知，因此很难做到加入多少内标。

而现在大多数都加入等量内标，来测不同含量的标本里的核酸的量。

因此就出现了，比如1×106 的模板核酸的标本，用5×103 次方的内标时，出现内标失败。

虽然认为污染也不会污染到1×106 ，但毕竟内标的失败也就失去了意义。

同样的实验也发现5×103 的内标它可以抑制1×102 的模板的扩增。

由此看来高核酸模板的标本，可以抑制内标的扩增。

而低含量模板的标本，又会被内标的扩增抑制，因此内标严重影响了扩增的敏感性。

　临床基因扩增实验室近年来在我国发展很快，基因诊断技术在疾病的预防、诊断、治疗方面起到了积极的作用。

由于基因扩增检测技术的应用对实验室的环境条件、仪器设备、试剂耗材、人员技术能力和质量控制等方面要求严格。

为了规范实验室，保证基因扩增技术有效应用，防止假阴性、假阳性结果的报出，为临床出具合格而可靠的报告，规范临床基因扩增实验室是必然而且也是必要的。

1、荧光PCR仪器的功能模块分为（d）

A、温度模块

B、光学模块

C、软件模块

D、以上都对

2、按照操作说明进行操作，但环节控制、环节间衔接和防污染意识差的实验室人员属于（a）

A、实习型

B、工作型

C、示教型

D、专家型

3、荧光PCR检测的实验室分区，至少要有（d）

A、核酸提取区

B、PCR扩增区

C、开放产物分析区

D、清洁的试剂配制和核酸制备区

4、试剂配制室的设置与维护的做法中，错误的是（a）

A、离心机等不用擦拭

B、正压、清洁进风（壁挂式空调）

C、有效氯消毒液清洁实验室台面、地面

D、移液器：

使用前的清洁

5、质控品的设立中，哪项是对精密度的考核（a）

A、临界对照

B、空白对照

C、阴性对照

D、等效定量标准品

6、2003年，PCR在哪种疾病的早期诊断中非常有效（b）

A、H1N1甲型流感

B、SARS

C、N7N9

D、肿瘤易感基因

7、关于PCR实验中实验室分区目的的说法不对的是（a）

A、避免气溶胶扩散

B、避免标本间的交叉污染

C、避免标本、试剂或使用器具等污染

D、避免标本掺入污染

8、试剂配制时，如何避免荧光淬灭（c）

A、避免反复冻溶

B、应在紫外灯下配制

C、避免在强光下配制

D、以上都不是

9、荧光PCR检测中，空白对照的作用是（）

A、是实验精确度需求

B、监控扩增试剂及环境污染

C、是实验准确性前提

D、监控试剂是否污染

10、影响临床荧光PCR检测结果的常见因素中，属于非检验因素的是（a）

A、标本保存条件、时间

B、实验室硬件

C、仪器、试剂

D、管理水平