发酵复习重点.docx

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发酵复习重点

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第一章绪论

1.名词解释：

发酵工程

现代发酵工程：

采用现代工程技术手段，利用生物细胞的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程中的一种新技术。

2.发酵过程中包括哪些环节？

发酵工程的内容包括了以下的基本步骤：

1.菌种的选育

2.培养基的配置

3.灭菌

4.种子扩大培养和接种

5.发酵过程控制

6.发酵动力学及代谢机理

7.发酵过程的比拟放大

8.分离提纯

3.简述发酵工程的发展历史。

⏹1.传统发酵工业：

●从人类出现到19世纪中期

⏹2.近代发酵工业建立时期

●19世纪50年代到20世纪40年代

⏹3.近代发酵工业全盛时期

●从20世纪40年代初到70年代末

⏹4.现代发酵工业建立和发展

●20世纪70年代末至今

4.发酵工业的研究范围包括哪几个方面？

⏹1.微生物菌体发酵

⏹2.微生物酶发酵

⏹3.微生物代谢产物发酵

⏹4.微生物转化发酵

⏹5.生物技术的生物细胞发酵

5.简述发酵工程的主要前沿进展。

主要研究：

人工选育和改良菌种

⏹高等动植物细胞培养

⏹固定化技术广泛应用

⏹开发大型节能高效的发酵装置

⏹强调代谢机理与调控研究

⏹将生物技术广泛地用于环境工程

⏹混合菌发酵

前沿进展：

⏹过程优化技术

⏹多尺度生物反应器优化控制技术

⏹生物炼制

第二章菌种选育

1.发酵工业对菌种的要求有哪些，菌种的来源有哪些？

⏹原料廉价，生长迅速，目的产物产量高；

⏹培养条件易于控制，发酵周期较短；

⏹抗噬菌体及杂菌污染的能力强；

⏹菌种不易变异退化；

⏹对放大设备的适应性强；

⏹菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。

●从自然界筛选

●菌种保藏机构

●从发酵制品中分离

2.常见的菌种选育方法有哪些？

经典育种：

自然选育，诱变育种，有一定盲目性。

定向育种：

杂交育种，分子育种（DNA重组技术）

3.诱变育种诱变剂有哪些？

物理

诱变剂

化学诱变剂

生物

诱变剂

碱基类似物

与碱基反应的物质

DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质

紫外线

2-氨基嘌呤

硫酸二乙酯（DES）

吖啶类物质

噬菌体

转座子

快中子

5-溴尿嘧啶

甲基磺酸乙酯（EMS）

ICR类物质

（美国肿瘤

研究所合成

的吖啶类的）

氮芥衍生物

X射线

8-氮鸟嘌呤

亚硝基胍（NTG）

γ射线

8-AG

亚硝基甲基脲（NMU）

激光

亚硝基乙基脲（NEU）

亚硝酸（NA）

氮芥（NM）

4-硝基喹啉1-氧化物

乙烯亚胺（EI）

羟胺

如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等

4.菌种保藏有哪些主要方法？

⏹1、斜面低温保藏

⏹2、液体石蜡覆盖保藏

⏹3、沙土管保藏法

⏹4、悬液保藏法

⏹5、真空冷冻干燥保藏法

⏹6、低温保藏法

⏹7、液氮超低温保藏法

第三章微生物培养基

1.组成工业培养基的主要成分有哪些，各成分来自哪些资源？

一、碳源

种类：

⏹糖：

单糖中的己糖，寡糖中的蔗糖、麦芽糖、棉子糖，多糖中的淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等，其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。

⏹有机酸如糖酸、柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。

⏹醇类中甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。

⏹脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。

油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。

⏹正烷烃：

一般是指从石油裂得到的14C至18C的直链烷烃混合物。

①葡萄糖②糖蜜（糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。

）③淀粉、糊精

二、氮源

1、无机氮源

种类：

氨盐、硝酸盐和氨水

2、有机氮源

来源：

工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。

三、无机盐及微量元素

五、生长因子、前体和产物促进剂

五、水

2.培养基有哪些类型？

按纯度

1）天然培养基

（2）合成培养基

（3）半合成培养基

按状态

（4）固体培养基（琼脂）

（5）半固体培养基

（6）液体培养基

按用途

7）孢子（斜面）培养基

（8）种子培养基

（9）发酵培养基

按作用

（10）基本培养基

（11）鉴别培养基

（12）增殖培养基

（13）选择培养基

3.影响培养基质量的因素有哪些？

⏹原料及设备的预处理

⏹原材料的质量

⏹发酵特性的影响

⏹灭菌

⏹水质的影响

⏹其他影响因素

第四章灭菌

1.

为什么采用高温、瞬时灭菌？

t=

反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大。

∵ΔE>ΔE’，∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌。

由于杀死微生物的活化能ΔE大于营养成分破坏的活化能ΔE’，温度升高，灭菌反应速率常数（比死亡速率）增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数，因而在较高的温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。

2.为什么湿热灭菌比干热灭菌温度低时间短？

1、热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。

水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。

蛋白质含水量与其凝固温度成反比。

2、热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物：

3、蒸汽存在潜热．当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。

①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。

湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，因较大同一温度的干热空气中易于凝固。

②湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。

③温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度。

因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。

3.培养基灭菌的方法？

1.热灭菌法

2.化学灭菌法

3.辐射灭菌法

4.过滤除菌法

5.臭氧除菌法

（一）分批灭菌:

将配好的培养基放在发酵罐和其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。

（二）连续灭菌

培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺过程成为连续灭菌，又称连消。

连续灭菌工艺流程：

●1、蒸汽直接加热连续灭菌

Ø喷淋冷却连续灭菌流程

Ø喷射加热连续灭菌流程

●2、蒸汽间接加热连续灭菌

Ø薄板式换热器连续灭菌流程

4.连续灭菌的优缺点有哪些？

发酵罐体积越大，其分批灭菌的升温时间长，就更应考虑升温段的灭菌作用，其保温时间应更短。

发酵罐体积越大，培养基在高温下持续时间也越长，遭受破坏也越严重。

这正是大体积培养基灭菌常选用连续灭菌的原因。

特点：

连续灭菌以“高温、快速”为特征。

优点：

⏹1.可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；

⏹2.发酵罐利用率高；

⏹3.蒸汽负荷均衡，操作方便；

⏹4.采用板式换热器时，可节约大量能量；

⏹5.适宜采用自动控制，劳动强度小。

缺点：

●1.不适合用于粘度大或固形物含量高的培养基；

●2.增加一套连续灭菌设备，增加操作环节，增加染菌概率。

5.空气灭菌的方法？

●加热灭菌、

●静电除菌、

●过滤介质除菌、

●辐射除菌、

●化学灭菌等。

第五章菌种的扩大培养

1、种子必须具备的条件

●①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长

●②生理性状稳定

●③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求

●④无杂菌污染（不带杂菌）

●⑤生产能力稳定

2、种子扩大培养定义、流程

定义：

是指将保藏的菌种，即砂土管、冷冻干燥管、斜面试管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。

这些纯种的培养物称为种子。

●种子制备过程可分为两个阶段：

Ø一、实验室种子制备

Ø二、生产车间种子制备

3、影响种子质量的因素

v原材料质量

原材料质量波动的主要原因：

无机离子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。

v培养温度

温度过低，菌种生长发育缓慢

温度过高会使菌丝过早自溶

v湿度

相对湿度影响孢子生长速度、数量、质量。

v通气与搅拌

足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量。

搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。

v斜面冷藏时间

对孢子的生产能力有较大影响

冷藏时间越长，生产能力下降越多

v培养基

vpH

选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量

v种龄

大量地接入培养成熟的菌种可缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设

备利用率节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会。

v接种量

接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足

接种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌

以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据

接种量的大小直接影响发酵周期。

第六章发酵设备

1.原料处理设备和固体物料输送设备的类型

⏹一、生物质原料筛选与分级

（1）筛选设备

磁力除铁器①永磁溜管②永磁滚筒

例：

平板式磁分离器、旋转式磁分离器

（2）精选机①滚筒式精选机

（3）筛选分级设备①振动筛②转筒筛

⏹二、生物质原料的粉碎

①锤式粉碎机

②盘磨机

③球磨机

④辊式粉碎机

⏹三、生物质原料固体间的混合

（1）回转型混合机①水平圆筒型混合机②倾斜圆筒型混合机

（2）固定型混合机①搅拌槽式混合机：

螺旋带状搅拌器，中心两端搅拌。

②回转圆盘型混合机：

高速旋转的圆板离心力作用。

③锥形混合机

固体物料输送设备

一、斗式提升机

二、带式输送机

三、螺旋输送机

四、气力输送系统

2.通用式发酵罐的主要部件及其作用

•皮带轮转轴

•轴封作用：

使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄漏和污染杂菌。

种类：

①填料函式轴封②端面式轴封

•消泡器（未显示）作用：

将泡沫打破。

种类：

锯齿式、梳状式及孔板式

•搅拌器作用：

打碎气泡，使空气与溶液均匀接触，使氧溶解于醪液中。

种类：

①轴向式（桨叶式、螺旋桨式）②径向式（涡轮式）

•联轴器作用：

用联轴器使几段搅拌轴上下成牢固的刚性联接。

形式：

鼓形及夹壳形两种

•中间轴承

•挡板作用：

a、改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。

b、防止搅拌过程中漩涡的产生，而导致搅拌器露在料液以上，起不到搅拌作用。

•空气分布管作用：

吹入无菌空气，使空气分布均匀。

•换热装置

种类：

①夹套式换热装置②竖式蛇管换热装置

•人孔以及管路等

3.气升式、自吸式、伍式和文式管发酵罐的结构和工作原理

气升式发酵罐分为内循环和外循环两种，其主要结构包括：

罐体、上升管、空气喷嘴等部分。

循环管高度是影响循环效率的主要因素，实践证明不应少于4m。

气升环流式反应器是在反应器内没有搅拌器，其中央有一个导流筒，将发酵醪液分为上升区（导流筒内）和下降区（导流筒外），在上升区的下部安装了空气喷嘴，或环型空气分布管，空气分布管的下方有许多喷孔。

加压的无菌空气通过喷嘴或喷孔喷射进发酵液中，从空气喷嘴喷入的气速可达250~300（米/秒），无菌空气高速喷入上升管，通过气液混合物的湍流作用而使空气泡分割细碎，与导流筒内的发酵液密切接触，供给发酵液溶解氧。

由于导流筒内形成的气液混合物密度降低，加上压缩空气的喷流动能，因此使导流筒内的液体向上运动；到达反应器上部液面后，一部分气生泡破碎，二氧化碳排出到反应器上部空间，而排出部分气体的发酵液从导流筒上边向导流筒外流动，导流筒外的发酵液因气含率小，密度增大，发酵液则下降，再次进入上升管，形成循环流动，实现混合与溶氧传质。

自吸式发酵罐的充气原理：

   叶轮旋转时叶片不断排开周围的液体使其背侧形成真空，由导气管吸入罐外空气。

吸入的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，并立即通过导轮向罐壁分散，经挡板折流涌向液面，均匀分布。

自吸式发酵罐的结构特点：

   自吸式发酵罐罐体的结构大致上与通用式发酵罐相同，主要区别在于搅拌器的外形和结构不同。

自吸式发酵罐使用的是带中心吸气口的搅拌器。

搅拌器由从罐底向上伸入的主轴带动，叶轮旋转时叶片不断排开附近的液体使其背侧形成真空，于是将罐外空气通过搅拌器中央的吸气管而吸入罐内，吸入的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，并立刻通过导轮向罐壁分散，经挡板折流涌向液面，平均分布。

空气吸入管通常用一端面轴封与叶轮连接，确保不漏气。

伍式发酵罐的主要部件是套筒、搅拌器。

伍式发酵罐工作原理

搅拌时液体沿着套筒外向上升至液面，然后由套筒内返回罐底，搅拌器是用六根弯曲的空气管子焊于圆盘上，兼作空气分配器。

空气由空心轴导入经过搅拌器的空心管吹出，与被搅拌器甩出的液体相混合，发酵液在套筒外侧上升，由套筒内部下降，形成循环。

文式管发酵罐原理

用泵将发酵液压入文氏管中，由于文氏管的收缩段中液体的流速增加，形成真空将空气吸入，并使气泡分散与液体混合，增加发酵液中的溶解氧。

4.识别不同类型发酵罐结构图

第七章发酵工艺控制

1.发酵过程监控的主要指标

（1）物理检测指标：

温度；气体流速；搅拌转速；泡沫；压力；功耗；粘度等。

（2）化学检测指标：

pH；糖含量；溶解氧；氧化还原电位；溶CO2；基质、前体、产物含量等。

（3）生物检测指标：

菌体浓度；中间代谢产物；ATP；各种酶活力。

2.发酵过程主要参数对发酵过程的影响和控制方法（温度、pH、溶氧、二氧化碳、补料、泡沫、染菌）

①温度

（1）影响发酵液的物理性质

Ø粘度、基质和氧的溶解度和传递速率

（2）影响细胞的各种代谢过程，酶反应的速率和蛋白质的性质

Ø1.能改变菌体代谢产物的合成方向，

如金色链霉菌>35℃时，合成四环素；<30℃时，合成金霉素。

Ø2.影响碳源基质转化为细胞的得率。

Ø3.几乎所有微生物的脂质成分均随生长温度变化。

温度的控制：

理论上，应该根据发酵的不同阶段，选择不同的培养温度。

影响发酵温度变化的因素：

生物热、搅拌热、蒸发（汽化）热和辐射热等。

②pH

（1）影响酶的活性。

影响酶活性中心上有关基团的解离；影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶——底物的结合。

（2）影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄。

（3）引起菌体的代谢过程不同。

pH的控制：

1.调节好基料的pH；

2.通过补料调节pH；

3.当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH；

4.选择合适的pH调节剂；

5.发酵的不同阶段采取不同的pH值。

（1）调节好基础料的pH基础料中若含有玉米浆，PH呈酸性，必须调节PH。

若要控制灭菌后PH在6.0，灭菌前PH往往要调到6.5-6.8。

（2）在基础料中加入维持PH的物质如CaCO3,或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。

（3）通过补料调节PH

（4）当补料与调PH发生矛盾时，加酸碱调节PH

③溶氧

（1）溶氧对菌体生长的影响

（2）溶氧对产物合成的影响

溶氧控制：

④CO2

（1）对微生物生长的影响

ØCO2对微生物生长和发酵具有刺激或抑制作用，此现象称为CO2效应。

ØCO2受限制可能导致适应（停滞）期的延长；菌丝形态随CO2含量不同而改变。

（2）对产物合成的影响

ØCO2对某些发酵也有促进

如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。

ØCO2对某些发酵的抑制

如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等发酵的抑制。

（3）影响发酵液的酸碱平衡

CO2的控制：

CO2浓度大小受到菌体的呼吸强度、发酵液流变学特性、通气搅拌程度和外界压力大小等许多因素影响。

罐内的CO2分压是液体深度的函数，CO2的溶解度随压力增加而增大。

CO2的产生与补料工艺控制密切相关。

补糖会增加排气中CO2的浓度和降低培养液的pH。

⑤补料

（1）补料的策略

优化补料速率要根据微生物对养分的消耗速率及所设定的发酵液中最低维持浓度而定。

（2）补料的依据

Ø菌的形态，

Ø比生长速率，

Ø发酵液中糖浓度，

Ø溶氧浓度，

Ø尾气中的氧和CO2含量，

Ø摄氧率或呼吸商的变化。

⑥泡沫

泡沫给发酵带来的副作用：

①降低了发酵罐的装料系数

②增加了菌群的非均一性

③增加了污染杂菌的机会

④大量起泡，会引起逃液

⑤影响通气搅拌，菌体呼吸受到阻碍

⑥消泡剂的加入有时会影响发酵或给提炼工序带来麻烦。

泡沫的控制：

Ø①采用机械消沫；

Ø②消泡剂消沫；

Ø③调整培养基中的成分，或改变某些物理化学参数，或者改变发酵工艺；

Ø④从生产菌种本身的特性着手，预防泡沫的形成。

⑦染菌

1.生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。

2.杂菌也会产生代谢产物，使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。

3.有些杂菌会分解产物，使生产失败。

4.杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。

5.如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。

染菌的控制：

●物料、培养基、中间补料要灭菌；

●发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；

●好气发酵通入的空气要除菌；

●种子无污染；接种无菌操作过关；

●为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。

3.发酵终点判断需考虑的因素

最低成本获得最大生产能力的时间。

要确定一个合理的放罐时间，须要考虑下列几个因素：

1.考虑经济因素

Ø以最低的成本来获得最大生产能力

2.产品质量因素

Ø发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大影响

3．特殊因素

Ø异常情况；加糖、补料或消沫剂确定放罐的指标：

产物的产量、过滤速度、氨基氮的含量、菌丝形态、pH值、溶氧（DO）、发酵液的粘度和外观等。