实验四 植物胚的初代培养.docx
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实验四植物胚的初代培养
实验四、植物胚的初代培养
一、实验目的
1、掌握外植体的选取与消毒技术
2、掌握无菌操作接种技术
二、实验原理
离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。
胚状体的形成是指从培养的组织或细胞中直接或间接形成胚胎的生长方式。
直接形成胚胎是指在外植体上直接分化出胚状体；间接形成胚胎是指在外植体上先分化出胚性愈伤组织，然后由胚性愈伤组织再分化形成胚状体。
初代培养：
即接种某种外植体后，最初的几代培养。
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。
初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。
初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。
脱分化：
已经分化的植物器官、组织或细胞，当受到创伤或进行离体（也受到创伤）培养时，已停止分裂的细胞，又重新恢复分裂，细胞改变原有的分化状态，失去原有结构和功能，成为具有未分化特性的细胞。
脱分化的机理：
离体后细胞膜的透性改变，细胞核增大，内质网扩大，蛋白质，酚类物质的合成活跃，从中完成了脱分化。
再分化：
已经脱分化的细胞在一定条件下，又可经过愈伤组织或胚状体，再分化出根和芽，形成完整植株。
影响再分化的因素：
损伤
培养基中成长素与细胞分裂素的配比
培养条件，光照温度
细胞团的位置
外植体的生理状况
植物体种类差异
.愈伤组织：
脱分化后的细胞经过细胞的分裂增值形成一团无特定及结构和功能的薄壁细胞群。
细胞的再分化：
育体培养的细胞组培由脱分化状态重新进行分化，形成种或几种细胞组织器官，甚至发育为完整植株的过程。
（一）培养指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程
（二）培养方法
1．固体培养法：
即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。
是现在最常用的方法。
该法设备简单，易行。
但养分分布不均，生长速度不均衡。
并常有褐化中毒现象发生。
2．液体培养法：
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。
由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100转／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。
3、外植体的生长与分化
（1）顶芽和腋芽发育：
以植物茎尖、顶芽、侧芽或带有芽的茎段作为外植体，在外源的细胞分裂素作用下，顶芽或休眠侧芽萌发生长，伸长形成多节茎段的茎梢，或形成一个微型多枝多芽的小灌木丛状结构。
该发育方式具有萌发时间段，成苗快，不经过愈伤组织再生，能使无性系后代保持原品种特性等特点。
（2）不定芽发育
在初代培养中一些植物的叶片、不带腋芽茎段先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织块上分化形成不定芽；而有些植物，如球根秋海棠、非洲紫罗兰、百合、贝母等，不定芽可直接从外植体表面受伤的或没有受伤的部位直接分化出来。
（3）原球茎发育：
在兰花和部分球根植物的种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，形成的小圆锥状胀大的胚称为原球茎。
在植物组织培养中，从兰花的顶芽、侧芽组织中或从种子中萌发的植株器官，都能诱导这样的原球茎。
往往在一个芽的周围能产生几个到几十个原球茎，培养一段时间后，原球茎可发育成完整的再生植物。
（4）胚状体发育：
胚状体是由体细胞形成的、类似于生殖细胞形成合子胚发育过程的胚胎。
胚状体可以从愈伤组织表面，也可由外植体表面已分化的细胞或从悬浮培养的细胞中产生。
胚状体发育出的再生小植株与腋芽苗或不定芽苗有显著差异：
一是胚状体在形成的最初阶段，多来自单个细胞或多个细胞团，很早就具有明显的根端于苗端的两极分化，极幼小
时就是一个根芽齐全的微型结构，通常不需要诱导生根阶段；二是由胚状体发育成的植株成的植株与周围的愈伤组织或母体组织块之间，几乎没有什么结构性的联系，小植株是独立形成的，易于与其他部分分离，胚状体小植株通过振摇或镊子、解剖针等轻拔就可彼此分开。
而由腋芽或不定芽发育来的小植物，它们最初由分生细胞团形成单极性的生长点发育而来，随后再转移到生根培养基上形成根，才能形成完整的小植株。
通常它们与母体组织块或愈伤组织之间有着较紧密的连接，包括一些维管束、皮层和表皮组织等，因而不易分离，在转移时往往用刀切才能分开。
4、 胚培养的类型：
成熟胚（matureembryo）培养；幼胚（immatureembryo）培养
5、植物胚胎发生的类型
1.双子叶植物：
合子—原胚—球形胚—心形胚—鱼雷胚和极胚—子叶胚
2.单子叶植物：
合子—原胚—球形胚—盾形胚
3.离体培养植物：
外植体—愈伤组织--球形胚—心形胚—鱼雷胚和极胚—子叶胚
（一）培养
指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程
（二）培养方法
1．固体培养法
即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。
是现在最常用的方法。
该法设备简单，易行。
但养分分布不均，生长速度不均衡。
并常有褐化中毒现象发生。
2．液体培养法
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。
由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100转／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。
3、外植体的生长与分化
（1）顶芽和腋芽发育
以植物茎尖、顶芽、侧芽或带有芽的茎段作为外植体，在外源的细胞分裂素作用下，顶芽或休眠侧芽萌发生长，伸长形成多节茎段的茎梢，或形成一个微型多枝多芽的小灌木丛状结构。
该发育方式具有萌发时间段，成苗快，不经过愈伤组织再生，能使无性系后代保持原品种特性等特点。
（2）不定芽发育
在初代培养中一些植物的叶片、不带腋芽茎段先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织块上分化形成不定芽；而有些植物，如球根秋海棠、非洲紫罗兰、百合、贝母等，不定芽可直接从外植体表面受伤的或没有受伤的部位直接分化出来。
植物的茎段、叶、叶柄、根、花茎、萼片、花瓣等器官都可以作为外植体诱导产生不定芽。
但由不定芽产生的苗具有更大的性状变异几率，观赏植物中有不少遗传学嵌合体，如金边虎尾兰、花叶玉簪、金边巴西铁树等，这些镶嵌色彩的叶子和一些带金银边的植物，在通过不定芽途径时，再生植株便失去这些富有观赏价值的特征。
（3）原球茎发育
在兰花和部分球根植物的种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，形成的小圆锥状胀大的胚称为原球茎。
在植物组织培养中，从兰花的顶芽、侧芽组织中或从种子中萌发的植株器官，都能诱导这样的原球茎。
往往在一个芽的周围能产生几个到几十个原球茎，培养一段时间后，原球茎可发育成完整的再生植物。
（4）胚状体发育
胚状体是由体细胞形成的、类似于生殖细胞形成合子胚发育过程的胚胎。
胚状体可以从愈伤组织表面，也可由外植体表面已分化的细胞或从悬浮培养的细胞中产生。
胚状体发育出的再生小植株与腋芽苗或不定芽苗有显著差异：
一是胚状体在形成的最初阶段，多来自单个细胞或多个细胞团，很早就具有明显的根端于苗端的两极分化，极幼小时就是一个根芽齐全的微型结构，通常不需要诱导生根阶段；二是由胚状体发育成的植株成的植株与周围的愈伤组织或母体组织块之间，几乎没有什么结构性的联系，小植株是独立形成的，易于与其他部分分离，胚状体小植株通过振摇或镊子、解剖针等轻拔就可彼此分开。
而由腋芽或不定芽发育来的小植物，它们最初由分生细胞团形成单极性的生长点发育而来，随后再转移到生根培养基上形成根，才能形成完整的小植株。
通常它们与母体组织块或愈伤组织之间有着较紧密的连接，包括一些维管束、皮层和表皮组织等，因而不易分离，在转移时往往用刀切才能分开。
植物胚培养：
1．胚培养的意义和类型
胚培养在实践中的应用意义：
·克服杂交育种中杂种胚的早期夭折
·克服珠心胚干扰，提高育种效率
·理论研究领域的应用
胚培养的类型
成熟胚（matureembryo）培养；幼胚（immatureembryo）培养
2．幼胚培养
幼胚培养中，常见的生长方式有三种：
（1）、胚性发育幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚（有时甚至可能类似种子），然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。
（2）、早熟萌发（earlymaturesprouting）幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。
在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。
（3）、愈伤组织（callus）在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。
一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。
3、子房培养
子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养
植物胚胎发生的类型
1.双子叶植物：
合子—原胚—球形胚—心形胚—鱼雷胚和极胚—子叶胚
2.单子叶植物：
合子—原胚—球形胚—盾形胚
3.离体培养植物：
外植体—愈伤组织--球形胚—心形胚—鱼雷胚和极胚—子叶胚
6、植物体细胞胚胎发生途径：
（1）直接途径：
从外植体的愈伤组织中直接诱导出体细胞胚胎
（2）间接途径：
外植体先脱分化形成愈伤组织，然后愈伤组织再分化和分裂。
7、植物体细胞胚胎发生的特点：
植物胚胎的发生是从合子开始的
单细胞悬浮培养，原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生
合子发育的胚胎为二倍体的体细胞产生的胚状结构
体细胞胚胎是由小孢子或其分裂产物等单细胞体细胞产生的体细胞的胚
8、植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点：
1具有两极性
2存在生理隔离
3遗传性相对稳定
4重演受精卵形态发生的特性
9、影响体细胞胚胎发生的因素:
1、基因型与体细胞胚发生
基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异
2、植物激素与体细胞胚发生
离体植物细胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力，但是在大多数情况下，这些细胞的分裂和分化以及形态建成过程中又必需生长素和细胞分裂素两种激素的共同作用。
3、初代培养物的建立
1）、保证无菌
2）、条件合适：
首先,一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位;其次,一定要选择合适的培养基,激素及其他添加物;还要注意掌握适宜的环境条件。
所以在进行一种植物的组织培养之前,应查找该种植物有关方面的资料,根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技术等,再决定自己的工作步骤。
3）、操作技术过关
三．材料，试剂及仪器用具
1．材料与试剂：
外植体MS培养基已灭菌2%次氯酸钠0.1%吐温20（或吐温8070%~75%酒精无菌水等。
2.仪器与用具：
超净工作台酒精灯敢惹灭菌器接种工具（已灭菌的解剖刀剪子镊子垫盘及吸水纸）标签或记号笔
四．实验内容
1.外植体的取材与消毒
2接种
3.培养：
将接种后的培养瓶及时转移到培养室内。
一周后培养室内保持光照每天16h，光照强度2000~3000lx，温度25左右。
五．观察记载及结果统计
经常检查培养瓶，发现污染要及时清除。
定期观察接种材料的生长情况，并做好记录。
表格如下：
材料名称：
培养基编号及配方：
接种时间：
接种情况：
组号：
2外植体：
松柏接种植物：
松柏接种日期：
2013年4月12日
编号
接种数
污染情况（%）
褐变率
愈伤率
3
5
80%
80%
20%
2
3
100%
100%
0
1
4
100%
100%
0
4
4
100%
100%
0
六．注意事项
1初代培养中的污染，褐变等常见问题
（一）引起污染的主要原因有：
（1）外植体消毒不彻底
（2）培养基及各种使用器械灭菌不彻底
（3）接种时操作人员未严格遵守无菌操作过程
（4）接种和培养环境不清洁
（二）污染预防措施：
根据可能引起污染的原因，预防污染的措施主要采取以下几点措施：
（1）严格消毒。
（2）严格培养基及各种接种器械的灭菌
（3）严格环境消毒和无菌操作
2、初代培养污染的防治
1）、植物材料的选择及防止污染
通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多;老的材料比幼嫩的材料带菌多;田间生长的材料比温室生长的材料带菌多;带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。
为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择,以减少污染的发生。
用茎尖作外植体时,应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。
将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中,使其发枝,然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体,便可大大减少材料的污染。
或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时取材,也可明显地减少污染。
对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法。
如将切好的外植体放入1.3%次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液）消毒30min,然后用无菌水冲洗3次,再放在无菌条件下,次日用2.6%次氯酸钠灭菌30min,然后用无菌水冲洗3次。
也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果。
材料内部易感染病菌,在这种情况下,必须在培养基中加入抗生素类,防止初代培养物污染。
2）、人为污染的防止：
接种前应用肥皂将手仔细洗净后,再用70%酒精擦洗双手,并需及时剪除指甲。
在工作中特别要注意避免交叉感染,双手必须清洁,工具则用一次即需消毒一次。
工作人员呼吸所产生的污染,主要是接种时说话或咳嗽所引起的,因此,操作时严禁谈话,并应戴上口罩,也应穿工作服,戴工作帽。
污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染,这种细胞为芽孢杆菌。
法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌（Bacilluslenlus）,它外被荚膜,耐高温,一般消毒剂难以杀死。
它可随培养材料、用具等传播;它可出现在培养基表面,或呈滴形云雾状存在于培养基内。
若出现应严格灭菌,清洗用具,更换消毒酒精。
3、外植体的褐变：
外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐的现象。
它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。
在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。
4、褐变的主要原因如下：
（1）花卉品种：
研究表明，在不同花卉品种间的褐变现象是不同的。
由于多酚氧化酶活性上的差异，因此有些花卉品种的外植体在接种后较易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不易褐变。
故在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。
（2）生理状态：
外植体的生理状态不同，在接种后褐变程度也有所不同。
一般来说，处于同期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。
一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
（3）培养基成分：
浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些花卉外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。
（4）培养条件不当：
例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。
5、减轻褐变率的方法：
（1）选择合适的外植体：
一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
（2）合适的培养条件：
无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
（3）使用抗氧化剂：
在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。
另外使用0．1％～0．5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
（4）连续转移：
对容易褐变的材料可间隔12～24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。
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