质粒DNA的提取.docx

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质粒DNA的提取

实验一质粒DNA的提取

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1、恒温培养箱

2、恒温摇床

3、台式离心机

4、高压灭菌锅

（二）材料

1.葡萄糖

2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）

3.乙二胺四乙酸（EDTA）

4.氢氧化钠

5.十二烷基硫酸钠（SDS）

6.乙酸钾

7.冰乙酸

8.乙醇

9.盐酸（HCl）

10.Bt菌株

11.吸头、小指管

（三）试剂

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

3、溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA（pH8.0）

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

[实验步骤]

（一）提取质粒

1、将Bt菌株接种于LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。

7、12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。

8、向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。

12000r/min离心5min。

倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

9、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。

10、50μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[实验安排]

本实验一天内可做完。

实验结果可结合下一个实验一起观察。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA

[实验目的]

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。

[实验原理]

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：

超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA,简称CCCDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（opencircularDNA,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linearDNA, 简称LDNA）。

这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。

因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1、琼脂糖凝胶电泳系统

2、凝胶成像系统

（二）材料

1、三羟甲基氨基甲烷（Tris）

2、硼酸

3、乙二胺四乙酸（EDTA）

4、溴酚蓝

5、蔗糖

6、琼脂糖

7、溴化乙锭

8、DNAmarker

9、检测样品

（三）试剂

1、5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）

配1000ml5×TBE：

Tris54g

硼酸27.5g

0.5mol/lEDTA20ml（pH8.0）

2、凝胶加样缓冲液（6×）

溴酚蓝0.25%

蔗糖40%

3、琼脂糖

4、溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/ml

[实验步骤]

（一）制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb

0.35~60

0.61~20

0.70.8~10

0.90.5~7

1.20.4~6

1.50.2~4

2.00.1~3

称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，按100ml的凝胶加5μl的EB。

（二）胶板的制备

1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

2、将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3、将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4、待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。

5、加入电泳缓冲液至电泳槽中。

（三）加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

[实验安排]

可将上一次实验产物作电泳材料。

实验三PCR基因扩增

[实验目的]

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

[实验原理]

多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。

在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1、变性：

加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2、退火：

使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

3、延伸：

溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1、PCR热循环仪

2、琼脂糖凝胶电泳系统

3、凝胶成像系统

（二）材料

1、DNA模板

2、4种dNTP

3、引物1、引物2

4、Taq酶

5、琼脂糖

6、DNA相对分子质量标准物

7、吸头、小指管

（三）试剂

1、10×缓冲液

500mmol/lKCl

100mmol/lTris·HCl（pH8.3,室温）

15mmol/lMgCl2

0.1%明胶

2、4×dNTP

1mmol/ldATP

1mmol/ldCTP

1mmol/ldGTP

1mmol/ldTTP

3、Taq酶1U/μL

4、DNA模板1ng/μL

5、引物1

6、引物2

7、引物溶液浓度10pmol/μl

[实验步骤]

1、在0.5mlEppendorf管内配制25μL反应体系：

反应物体积/μL

10×buffer2.0

dNTP1.0

引物11.0

引物21.0

Taq酶0.5

Template1

ddH2O13.5

总体积20

2、按下列程序进行扩增：

①、95℃预变性5min

②、95℃变性1min

③、55℃退火2min

④、72℃延伸3min

⑤、重复步骤②~④30次；

⑥、72℃延伸10min

3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制0.7%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。

保持电流40mA。

电泳结束后，紫外灯下观察结果。

[实验安排]

本实验1天内可完成，上午做PCR反应，下午做电泳检测。

实验四DNA重组

[实验目的]

通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。

[实验原理]

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：

T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：

首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5′磷酸基和3′羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。

因此人们找到了一个折中温度，即12~16℃，连接12~16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。

利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。

现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ′基因。

LacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。

宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。

LacZ′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。

由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。

因此，任何携带着lacZ′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。

而当有外源DNA片段插入到位于lacZ′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1、恒温摇床

2、恒温水浴器

3、恒温培养箱

4、台式离心机

5、低温离心机

（二）材料

1.胰蛋白胨

2.酵母提取物

3.氯化钠（NaCl）

4.氨苄青霉素

5.氯化钙（CaCl2）

6.二甲基甲酰胺

7.EcoRI酶

8.T4DNA连接酶

9.DH5α

10.λDNA

11.pUC19质粒

12.培养皿

13.接种针

14.玻璃涂棒

15.试管

16.酒精灯

17.镊子、牙签等

（三）试剂

1、3mol/lKAc（pH5.2）

2、X-gal：

将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/ml，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20℃。

3、IPTG：

取2gIPTG溶于8ml双蒸水中，再用双蒸水补至10ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1ml，贮存于-20℃。

[实验步骤]

（一）质粒DNA的制备pUC19质粒由公司直接购买。

（二）制备重组DNA

1、在灭菌的Eppendorf管中，加入pUC19质粒2μL（2μg/μL），2μL酶切缓冲液，1μLEcoRI酶，无菌双蒸水15μL，至反应混合物总体积为20μL。

离心混匀，37℃反应3h（酶及缓冲液应放在冰上）。

2、在另一无菌Eppendorf管中，加λDNA1.5μg，加入1μL酶切反应液，1μLEcoRI酶，无菌双蒸水补到10μL，37℃反应3h。

3、反应完毕后，各取2μL酶解液做电泳分析。

4、分别将余下的酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc（pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃冰箱，2h（沉淀DNA）。

12000r/min4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上清，真空干燥后，加5μLTE溶液。

5、将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，14℃保温14h，并做转化实验。

[实验安排]

本实验结合下一个实验进行，E.coli感受态的制备和转化。

本实验约需要2天。

第一天：

配试剂，制备质粒DNA，做完DNA重组后，暂放冰箱保存。

第二天：

制备感受态细胞，铺琼脂板，细胞转化，倒置平皿37℃培养过夜（12~16h）。

第三天：

早晨观察结果。

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

[实验目的]

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法及技术。

[实验原理]

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1、超净工作台

2、低温离心机

3、恒温摇床

4、恒温箱

5、恒温水浴器

（二）材料

1、氯化钙（CaCl2）

2、胰蛋白胨

3、酵母提取液

4、氯化钠（NaCl）

5、氨苄青霉素

6、大肠杆菌DH5α

7、pUC19质粒

8、Eppendorf管

9、吸头、小指管

10、试管、培养皿、锥形瓶等

（三）试剂

1、1mol/lCaCl2溶液（高压灭菌）

2、LB液体培养基

配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：

胰蛋白胨（bacto-typtone）10g

酵母提取液（bacto-yeastextract）5g

NaCl10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。

3、氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。

4、LB固体培养基1000ml加15g琼脂。

[实验步骤]

1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2.取0.5ml菌液转接到一个含有50mlLB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养2~3h。

（此时，OD600≤0.4~0.5，细胞数务必<108/ml，此为实验成功的关键）。

3.吸菌液1ml加入Eppendorf管，10,000rpm离心15sec回收细胞。

4.用冰预冷的0.1mol/lCaCl2500μL悬浮沉淀。

5.再离心15sec（10000rpm），回收细胞。

6.再用冰预冷的0.1mol/lCaCl260μL重悬沉淀。

7.在-4℃下可保存2周（2~4d时，转化效率最高）。

此细胞为感受态细胞。

8.同时做两个对照管：

受体菌对照：

60μL感受态细胞+2μL无菌水

质粒对照：

60μL0.1mol/LCaCl2溶液+2μL质粒DNA溶液

9.将管放到42℃循环水浴1~2min。

10.冰浴2min。

11.每管加800μLLB液体培养基，37℃培养1h（慢摇）。

12.将适当体积（200μL）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。

13.倒置平皿37℃培养12~16h，观察细菌生长情况。

[实验安排]

本实验从制备感受态细胞到转化一天可做完，第二天早晨观察结果。