质粒dna的提取实验报告思考题doc.docx

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质粒dna的提取实验报告思考题

篇一：

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题　　1．实验目的：

（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；　　

（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方式和技术；　　2．实验材料及用品　　

（1）实验仪器（apparatus）：

　　恒温培育箱（Constanttemperatureincubator）、恒温摇床（Constanttemperatureshakingtable）、高速离心机（Highspeedcentrifuge）、漩涡振荡器（Vortexmixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduatedcylinder）、玻璃棒（stirbar）、微波炉（microwave）、天平（Panbalance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresistank）、电泳器（Electro-phoresisSystem）、紫外灯（Ultraviolettransilluminator）　　3）、材料与试剂（Reagents）：

　　①溶液I（SolutionⅠ）：

　　50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0　　溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

　　②溶液Ⅱ（SolutionⅡ）：

新鲜配制，等体积混合　　0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1%SDS（可用10％贮存液稀释配制）注意：

SDS易产生气泡，不要猛烈搅拌。

　　③溶液III（SolutionⅢ，100mL）：

加上后混匀会形成絮状沉淀　　60mL5mol/LKAc，　　11.5mL冰醋酸，　　28.5mLH2O（该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）　　④TE液缓冲液：

10mmol/LTris-HCl（pH8.0）；1mmol/LEDTA（pH8.0）　　⑤70%乙醇；　　⑥平衡酚：

氯仿1：

1：

　　将量取25mlTris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保留。

　　⑦LB培育基：

　　胰化蛋白胨10g　　酵母提取物5g　　NaCl15g　　pH7.0　　⑧琼脂糖（Agarose）；　　⑨1liter（升）5×TBE备用溶液（stocksolution）：

　　54gtrisbase，27.5g硼酸（boricacid），20ml0.5mol/LEDTA,pH8.0；　　⑩6×凝胶加样缓冲液：

　　0.25%溴酚蓝（bromophenolblue），40%蔗糖（sucroseinwater）；　　另外还有的试剂是：

胰RNA酶、DNAMarker、硼酸、Gelview试剂　　

（2）实验材料：

含有pUC19质粒的大肠杆菌等。

　　3．实验原理：

　　1）质粒DNA的提取：

（1）关于质粒：

　　质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。

质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。

细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。

一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。

（2）一般分离质粒DNA的方式都包括3个步骤：

　　①培育细菌，使质粒DNA大量扩增；　　②搜集和裂解细菌；　　③分离和纯化质粒DNA。

　　分离制备质粒DNA的方式很多，其中常常利用的方式有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。

在实际操作中可以按照宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点和质粒DNA的用途进行选择。

　　（3）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：

　　碱裂解法提取质粒DNA是按照共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的不同来分离质粒DNA。

　　在pH值介于12.0~12.5这个狭小的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，虽然在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此彼此盘绕，仍会紧密地结合在一路。

当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍维持在一路，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而彼此缠绕形成不溶性网状结构。

而复性的质粒DNA恢恢复来构型，维持可溶性状态。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一路沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。

　　2）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳：

（1）关于电泳技术：

　　电泳常常利用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。

正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为普遍的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常常利用的是琼脂糖凝胶电泳。

　　琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。

通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。

一般琼脂糖胶浓度在0.5％到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。

较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。

（2）琼脂糖凝胶电泳条带的观察：

　　通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。

溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速度大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。

当迁移足够距离后，就可以够通过Gelview染色来观察DNA片断。

Gelview是一种荧光染料。

它可以在做胶时混入其中在电泳　　时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色。

但必需将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。

　　（3）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分离：

　　DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。

在必然的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。

具有不同分子质量或不同构型的DNA分子泳动速度不一样，可以进行分离。

　　未切割的质粒DNA在其泳道上或许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。

质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：

　　①超螺旋DNA：

　　虽然质粒通常以开环的形式进行描述，但是在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。

这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。

②线性DNA：

　　当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速度介于超螺旋与切口质粒DNA之间。

　　③开环DNA：

　　在质粒DNA复制进程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。

在质粒分离进程中由于物理剪切和酶的切割作用一样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。

这种形式的质粒迁移速度最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。

　　4．实验方式步骤及注意事项　　1）实验方式步骤　　第一部份：

质粒DNA的提取及酶切　　

（1）取1.4ml含pUC19这里的大肠杆菌培育物于1.5ml微量离心管中，4000r/min离心2分钟，吸去上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥；　　

（2）加100ml溶液Ⅰ悬浮细菌沉淀，充分混和均匀，室温放置10min；　　（3）加200ml溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，轻缓上下4-6次倒置离心管以混合内容物。

将离心管静置冰上5min（使溶液变透明，粘稠）；　　（4）加200ml溶液Ⅲ（事前冰上预冷），盖紧离心管口后上下轻缓倒置4-6次，置冰上15min（溶液出现白色沉淀）；　　（5）12000rpm离心15min，转移上清液至另一离心管（弃沉淀）；　　（6）向上清液中加入等体积的酚：

氯仿（1：

1），反复混匀，12000rpm离心5min，取上清液移至另一离心管中；　　（7）加2倍体积无水乙醇，振荡混匀，静置10min，1XXrpm离心5－10min。

弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。

　　（8）加200ml70％乙醇洗涤沉淀物，1XXrpm离心2min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。

　　（9）沉淀加20μlTE,反复吹打使质粒DNA充分溶解，－20℃保留。

　　第二部份：

质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳　　Ⅰ.凝胶的制备（Preparationofthegel）　　

（1）制备1％琼脂糖凝胶：

　　称取0.5g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入50mL的0.5×TBE缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为0.5％琼脂糖凝胶液（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）；　　

（2）制胶器的安装：

　　①取多功能制胶器，洗净，晾干；　　②将多功能制胶器放置于一水平位置，选择12×6cm制胶架，然后选择1.5mm18teeth的梳子（最大加样量25μl）；　　③将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中；　　（3）将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview5μl；　　（4）将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）；　　（5）待胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中掏出，放入电泳槽内；　　（6）加入电泳缓冲液（0.5×）至电泳槽中；　　Ⅱ.加样（LoadingDNAsamples）：

　　用移液枪缓慢将DNA样品及其通过酶切的质粒DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方（记录点样顺序，以便作为对照和分析），各加样量如下：

　　DNAsamples：

15μl酶切的DNA样品：

3μl　　Loadingbuffer：

2μlDNAmarkers：

6μl　　（DNAsamples与Loadingbuffer总共加入20μl）　　Ⅲ.电泳（Gel）：

（1）接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

维持电压120V；　　

（2）当溴酚蓝染料移动到凝胶总长度一半处时，停止电泳；　　Ⅳ.GelInterpretation（凝胶图像解释）：

　　将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下进行DNA电泳条带的观察，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。

　　2）注意事项　　

（1）加溶液I后，必需要将菌体悬浮完全，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键；　　

（2）　　（3）TAE和TBE均为常常利用的缓冲液。

TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5kb的DNA一路迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

　　（4）DNA的迁移速度取决于以下因素:

　　①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

　　②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

　　③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

　　④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

　　（5）若是DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引发：

　　①DNA过载②电压太高③加样孔破损④凝胶中有气泡　　（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；　　二．实验内容　　1．实验现象与结果：

　　将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照取得的DNA电泳条带图如下所示意：

　　图注：

x’：

代表通过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；　　x：

代表未通过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；　　marker:

DNA相对分子质量标准物。

　　pUC19质粒DNA标准参照条带图像：

　　2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：

　　对实验现象的分析及其结论：

从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：

　　无论在DNASample中仍是在通过酶切处置后的DNA样品中均具有电泳迁移速度处于中间的线性质粒DNA。

而在这次实验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的进程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。

　　这说明质粒制备进程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。

可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的极可能就是蛋白质组分），或在实验的提取进程中加入溶液Ⅱ所经历的时间太长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组DNA。

　　可是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速度最快，跑在最前面的）。

标号为一、2和3组的电泳条带存在开环质粒DNA（与marker组的最后一条带相较较，同在一条水平线上且较亮的一条条纹即为开环质粒DNA），而且只出此刻未通过酶切的质粒DNASample中，这说明在这次实验进程中酶切是完全的。

　　从整体上观察，所有电泳条带的亮度并非高，可能是提取的质粒DNA量较少（浓度太低）或电泳前加样量过少所致。

　　5．作业　　1.简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，和实验中别离加入上述溶液后，反映体系出现的现象及其成因?

　　①溶液Ⅰ的作用：

悬浮大肠杆菌菌体，而且加溶液I后，必需要将菌体悬浮完全，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键。

且其中含有的溶霉菌可以水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因此具有溶菌作用。

另外葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及避免DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。

另外也可保证溶菌酶活性。

　　溶液Ⅱ的作用：

　　提供碱性条件，在NaOH与SDS的一路作用下使大肠杆菌刹时裂解，并变性核DNA。

当细胞悬浮于NaOH和十二烷基酸钠（SDS）溶液中使，在高pH（碱性环境）的作用下细胞发生裂解，另外蛋白质和染色体DNA发生变性与细胞碎片一路沉淀下来。

这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相转变。

新配制的溶液Ⅱ避免作为最佳溶解细胞的试剂—NaOH接触空气中的CO2太久而减弱了碱性。

用不新鲜的0.4MNaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。

因此必需利用新鲜的0.4MNaOH试剂进行配制。

　　溶液Ⅲ的作用：

　　该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基硫酸钠（即SDS与NaOH所形成的可溶性物质）发生反映形成十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），从而将与之结篇二：

质粒DNA测定生化实验报告　　生物化学实验报告　　姓名：

杨晓霞　　学号：

31XX0025　　专业年级：

XX级口腔　　组别：

第一实验室　　生物化学与分子生物学实验教学中心篇三：

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告　　质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定　　一、实验目的　　1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方式；　　2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方式；　　3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方式；　　4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方式；　　5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和利用方式。

　　二、实验原理　　1.PCR（多聚酶链式反映）　　在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方　　式呈指数形式扩增。

　　PCR一次循环的具体反映步骤为：

　　A.变性：

加热反映系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

　　B.退火：

逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃　　左右），与模板DNA互补退火形成部份双链。

　　C.延伸：

溶液反映温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复　　制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火以后延伸为一条双链。

　　2.质粒DNA的提取与制备　　

（1）.碱裂解法：

　　染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在不同：

　　A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；　　B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保留在溶液中，染　　色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

（2）.离心层析柱：

　　A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液　　中的蛋白质和多糖等物质；　　B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成份去除；　　C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

　　3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：

　　A.物质在光的照射下会产生对光的吸生效应，且其对光的吸收是具有选择性；　　B.各类不同的物质都具有其各自的吸收光谱:

　　DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰　　蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰　　碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰　　C.A260/A280及A260/A230的比值可以反映DNA的纯度；　　A260/A280=1.8DNA纯净　　A260/A280　　A260/A280>1.8含RNA杂质，用RNA酶去除。

　　4.质粒DNA的酶切鉴定：

　　限制性内切酶是DNA重组操作进程中所利用的大体工具。

限制性内切酶能特异性地与　　一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其周围的特异位点结合，并　　在结合位点切割双链DNA。

　　5.琼脂糖凝胶电泳：

　　琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于　　琼脂糖的浓度。

　　DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

　　DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：

不同的DNA，分子量大小　　及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带（迁移速度与分子量的对数　　值成反比关系）.　　三、材料与方式：

（一）实验材料：

　　1.PCR　　仪器：

PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管　　材料：

菌液【大肠杆菌DH5a菌株（pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP）】、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物　　2.质粒DNA的提取与制备　　仪器：

恒温培育箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管　　材料：

溶液P1（S1）、溶液P2（S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）漂洗液　　WB（W2）、洗脱液EB（Eluent）、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α　　3.质粒DNA的定量（紫外分光光度法）　　仪器：

比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪　　材料：

蒸馏水、质粒ＤＮＡ　　4.质粒DNA的酶切鉴定　　仪器：

1.5ml的EP管、微量加样枪　　材料：

无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII（15U/ul）、EcoRI（12U/ul）　　5.琼脂糖凝胶电泳　　仪器：

凝胶电泳系统、凝胶成像系统　　材料：

电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液　　

（二）实验方式　　1.PCR　　2.质粒DNA的提取与制备　　3.质粒DNA的定量（紫外分光光度法）