高效液相色谱法测定阿德福韦酯的含量.docx
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高效液相色谱法测定阿德福韦酯的含量
本科毕业论文
题目：
高效液相色谱法测定
阿德福韦酯的含量
学院：
化学与化工学院
班级：
09级化学6班
姓名：
丰志娟
指导教师：
关翠林职称：
副教授
完成日期：
2013年5月29日
高效液相色谱法测定阿德福韦酯的含量
摘要：
目的：
建立高效液相色谱法测定阿德福韦酯的含量。
方法：
采用高效液相色谱紫外检测法测定阿德福韦酯的含量，检测波长：
261nm;色谱柱：
十八烷基硅烷键合硅胶柱（5µm,250mm×4.6mm）；流动相：
0.02mol/L磷酸二氢钾-乙腈（用0.1mol/L氢氧化钾调pH至6.0）（60:
40）；流速：
1.0mL/min；柱温：
25℃；进样量：
20uL。
结果：
在0.0206～0.1032mg/mL范围内，线性关系良好（r=0.9997）,平均加样回收率为99.89%，RSD为0.14%。
结论：
此方法检测结果准确，重现性好，完全适用于阿德福韦酯含量的检测。
关键词：
高效液相色谱；阿德福韦酯；含量测定
目录
1引言.........................................................
（1）
1.1高效液相色谱概要.........................................
（1）
1.2课题背景和意义...........................................
（2）
2实验部分.....................................................（3）
2.1实验材料.................................................（3）
2.1.1实验仪器.............................................（3）
2.1.2实验试剂.............................................（4）
2.2实验方法.................................................（4）
2.2.1色谱条件.............................................（4）
2.2.2供试品溶液的配制.....................................（4）
2.2.3对照品溶液的配制.....................................（5）
3结果与讨论...................................................（5）
3.1系统适应性试验...........................................（5）
3.2标准曲线的绘制及线性回归分析.............................（6）
3.3精密度试验...............................................（7）
3.3.1重复性试验...........................................（7）
3.3.2中间精密度试验.......................................（7）
3.4溶液稳定性试验...........................................（8）
3.5回收试验.................................................（8）
3.6含量测定.................................................（9）
4结论.........................................................（11）
参考文献：
.....................................................（12）
ABSTRACT：
..................................................（13）
致谢：
.........................................................（14）
1引言
1.1高效液相色谱概要
高效液相色谱法是一种高效、快速及应用广泛的现代分离技术，具有分离效率高，选择性好、分析速度快、操作自动化、应用范围广的特点，已经成为有机物质分析的支柱技术，在生物化学、食品检验、临床医学、石油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用[1]。
其原理是根据混合物中各组分在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相做相对移动时，各组分在两项中进行反复多次分配，产生明显的分离效果，从而依次洗出色谱柱[2]。
根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。
1903年，俄国植物学家M.S.Tswett发表了题为“一种新型吸附现象及在生化分析上的应用”的研究论文，文中第一次提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。
1906年，他命名这种方法为色谱法。
这种简易的分离技术，奠定了传统色谱法基础[3]。
高效液相色谱法是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。
它是在经典液相色谱基础上，引入气相色谱理论，在技术上采用高压输液泵，梯度洗脱技术，新型高效填充剂以及各种高灵敏度检测器，与经典液相色谱法相比较，具有分析速度快，分离效率高，灵敏度高和操作自动化等优点。
它是吸纳了经典液相色谱法和气相色谱法的优点进行改进和发展起来的的现代分析方法[4]。
由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，可在柱后直接检测流出液成分，高效液相色谱法完成分离的时间只需几分钟到几十分钟，比经典色谱法快数百倍。
而且与气相色谱法相比，只要求试剂能制成溶液，而不需要气化，因此不受试剂挥发性的限制，对于高沸点、热不稳定性差、相对分子质量大的有机物，原则上都可用高效液相色谱法来进行分离，分析[5]。
化学药物是防病治病的重要药物，药物质量一直是非常重要的问题[6]。
高效液相色谱法问世不久就被应用于医学领域的某些研究工作，随着检测器和衍生化技术的发展以及样品预处理技术的改进，分析的灵敏度也明显提高[7]。
HTLP法应用于药物分析的数十年来，越来越成为药物分析的重要方法。
近年来，随着HTLP法在药物领域中的发展应用，HTLP法已经成为药物分析测定的主要手段。
液相色谱检测器（紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器）的多样性发展使得液相色谱的应用范围得到进一步拓宽。
1.2课题背景和意义
本品的中文名：
阿德福韦酯，系根据国家药典委员会编订的《中国药品通用名称》将“Adefovir”译为“阿德福韦”。
其英文名为AdefovirDipivoxil，是阿德福韦的双新戊酰氧基甲酯化物，故简称为“阿德福韦酯”。
分子式：
C20H32N5O8P，化学名：
9-[2-[双（新戊酰氧基甲氧基）磷酰甲氧基]乙基]腺嘌呤，本品外观性状为白色或类白色粉末，味微苦，熔点为:
97～103℃。
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）引起的一种严重危害人类健康的疾病[8]。
据统计，世界上大约有3.5亿慢性HBV携带者，每年大约有100万人死于HBV引起的疾病，世界卫生组织已把乙型肝炎列为世界第九死因。
在我国约有1.2亿人是乙肝病毒携带者，现患乙肝者2800万，患病率为2770/10万，且三分之一的人会演变成慢性肝炎、肝硬化或肝癌。
已确认的6种肝炎病毒中，乙型和丙型肝炎危害性最大，易转化为慢性肝炎，也是肝硬化和原发性肝癌的直接诱因。
1998年全世界有200万人死于这两种肝炎病毒引起的肝癌，中国也有30万人死亡。
一旦感染上肝炎，就必须长期不间断服药，我国每年对症治疗各种病毒性肝炎所需医疗费用约300～500亿元人民币。
高额的用药费用给国民经济和社会发展带来了巨大压力,如何预防和治疗肝炎成为当今重要的医学课题。
目前我国使用较多的肝炎用药（化学药物），大多为工艺改进的药物或进口药物，治疗肝炎的效果或不甚理想，或价格偏高，加剧了患者的用药负担。
核苷类药物是近年来抗HBV药物研究的热点，进展很快。
阿德福韦酯（adefovirdipivoxil）是一种核苷类广谱抗病毒药物[9]，是无环腺嘌呤单核苷酸衍生物阿德福韦（adefovir）的前药，它不稳定，易发生水解产生阿德福韦单酯和9-（2-膦酰甲氧乙基）腺嘌呤（PMEA）[10]。
口服吸收后，迅速被非特异性酶水解形成阿德福韦，再经两步磷酸酯化形成阿德福韦酯，后者可以与腺苷酸竞争性渗入病毒DNA链，作为终止物抑制DNA聚合酶，终止DNA新生链的合成,抑制病毒的复制，从
而发挥抗病毒作用。
[11]阿德福韦在体外具有抗肝DNA病毒、逆转录病毒和疱疹病毒的广谱抗病毒活性。
它在细胞内的活性代谢物为阿德福韦双磷酸酯，后者选择性抑制HBVDNA聚合酶。
由于阿德福韦的磷酸酯基带负电荷，阿德福韦口服后在肠内吸收不佳，因此开发了前药—阿德福韦酯，以提高生物利用度。
口服后前药部分迅速被酯酶水解释放出游离的阿德福韦进入门静脉和全身循环。
本药的研制开发可能为防治乙肝提供有力的武器。
阿德福韦酯（adefovirdipivoxil）由美国GileadSciences公司开发，于2002年9月20日被FDA批准用于治疗成人慢性乙肝（HBV），2005年被中国《慢性乙型肝炎防治指南》推荐为一线抗病毒药物[12]，是第二个被FDA批准上市的抗HBV药物。
剂型为口服片剂，规格10mg，商品名为Hepsera。
适应症包括代偿性慢性乙肝，HBeAg阳性和阴性的患者，对拉米夫定耐药的慢性乙肝（包括代偿或失偿肝病的患者），肝移植手术前后和合并HIV感染的慢性乙肝患者[13]。
迄今为止的临床实验中，患者对阿德福韦酯的耐受性较好。
其长期使用疗效稳定、病毒变异率低，在一定程度上减小了第一代核苷类药物诱发的病毒变异给医生带来的困扰[14]。
与目前治疗乙型肝炎的药物干扰素和拉米夫定相比，其在疗效、不良反应和传递方式等方面均有明显优势[15]，是目前比较理想的抗乙肝病毒的药物。
2实验部分
2.1实验材料
2.1.1实验仪器
LC-100高效液相色谱仪：
配LC-UV100紫外检测器，LC-P100高压恒流泵，LC-CO100柱恒温箱（上海伍丰仪器有限公司）
色谱工作站：
LC-UV100伍丰液相色谱工作站
溶剂微孔过滤膜（直径50mm,孔径0.45µm，美国津腾PALL原产膜）
SHB-IIIA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）
KQ-50B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）
HANGPINGFA2004电子天平（上海天平仪器厂）
吸量管（5ml,25℃）
容量瓶（100ml,50ml,25℃）
2.1.2实验试剂
乙腈（C2H3N,acetonitrile,色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司）
磷酸二氢钾（KH2PO4,potassiumdihydrogenphosphate,分析纯AR，天津市科密欧化学试剂有限公司）
氢氧化钠（NaOH,Sodiumhydroxide,分析纯AR，天津市科密欧化学试剂有限公司）
阿德福韦酯原料（C20H32N5O8P，AdefovirDipivoxil，由海南国栋药物研究所提供,批号：
20020601、20020602、20020603）
阿德福韦酯对照品（由海南国栋药物研究所提供，批号GD-2006，含量99.4%）
纯化水
2.2实验方法
2.2.1色谱条件
色谱柱：
十八烷基硅烷键合硅胶柱（5µm,250mm×4.6mm）
流动相：
0.02mol/L磷酸二氢钾：
乙腈（用0.1mol/L氢氧化钠调pH至6.0）（60:
40）
检测波长：
261nm
流速：
1.0mL/min
进样量：
20uL
柱温：
25℃
2.2.2供试品溶液的配制
取阿德福韦酯原料32mg，精密称定,置于50mL容量瓶中，加流动相适量振摇使之溶解后，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置于另一50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度,摇匀。
2.2.3对照品溶液的配制
另取阿德福韦酯对照品约32mg，精密称定,置于50mL容量瓶中，加流动相适量振摇使之溶解后，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置于另一50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度,摇匀。
3结果与讨论
3.1系统适用性试验
分别取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果见图1、图2。
图1对照溶液色谱图
Fig.1Chromatogramofreferencesubstance
图2样品溶液色谱图
Fig.2Chromatogramofsample
从上图测定结果可知，在2.2.1项色谱条件下，理论板数n＞2000；分离度R＞1.5。
3.2标准曲线的绘制及线性回归分析
取阿德福韦酯对照品约51.6mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释成每1mL中含阿德福韦酯0.516mg的溶液，摇匀，用吸量管移取该溶液1、2、3、4、5mL于5个25mL容量瓶中，加流动相定容,取各溶液连续进样，测量结果见表1。
表1线性关系试验结果
Table1Testresultsoflineardetermination
溶液浓度（mg/mL）
主峰面积
0.0206
618774
0.0413
1315489
0.0619
1933543
0.0856
2632950
0.1032
3236121
以峰面积对浓度作标准曲线如图3。
图3线性回归分析图
Fig.3Linearregressionanalysis
经线性回归分析，在0.0206～0.1032mg/mL范围内，线性关系良好。
3.3精密度试验
3.3.1重复性试验
取阿德福韦酯原料，加流动相制成浓度约为65ug/mL的供试品溶液，连续进样6次，结果如下：
表2重复性试验结果
Table2Testresultsofrepeatability
次数
1
2
3
4
5
6
主峰面积
1949110
1959609
1978056
1957556
1959852
1969403
平均峰面积
1962264
SD
10084
RSD
0.51%
试验结果表明，进样重复性能满足本品的含量测定要求。
3.3.2中间精密度试验
由不同的人于不同的时间在两台仪器上，取3.3.1项下的溶液，经多次取样，分别对本品进行含量测定，结果见下表。
表3中间精密度试验测定结果
Table3Testresultsofintermediateprecision
含量（%）
操作者A
操作者B
第1天
第2天
第1天
第2天
第一台
99.1
98.8
99.2
99.2
98.9
91.2
99.0
99.2
99.2
99.1
99.2
98.8
99.1
98.9
99.1
99.2
99.1
99.2
99.2
98.8
第二台
98.9
99.0
99.2
99.1
99.1
99.1
99.1
99.1
99.1
99.2
98.8
98.9
98.8
99.1
99.2
99.1
99.0
99.2
99.0
99.2
平均含量（%）
98.9
RSD（%）
1.26
试验结果表明，中间精密度试验相对标准偏差小于2.0%。
3.4溶液稳定性试验
取3.3.1项下的溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8小时取样分析，结果如下：
表4稳定性试验结果
Table4Testresultsofstabilization
时间（h）
0
2
4
6
8
峰面积
2107692
2097761
2114270
2079008
2093279
平均峰面积
2098402
SD
13610
RSD
0.65%
试验结果表明，在一个工作日内，室温条件下供试品溶液稳定。
3.5回收试验
精密称取阿德福韦酯原料25.6mg、32mg、38.4mg，分别置于100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，每个浓度配制3份。
取上述溶液及阿德福韦酯对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积，按外标法求得阿德福韦酯的含量，再根据样品的投入量计算其回收率，结果见表5。
表5加样回收率实验结果
Table5Testresultsofsamplerecoveryrate
加入量（百分比）
称量值（mg）
测量值（mg）
回收率（%）
回收率平均（%）
RSD（%）
80%
25.64
25.62
99.92
99.89
0.14
25.7
25.61
99.65
25.76
25.74
99.92
100%
32.1
32
99.69
32.12
32.1
99.94
32.05
32.07
100.06
120%
38.41
38.42
100.03
38.45
38.42
99.92
38.5
38.46
99.90
3.6含量测定
取本品三批，按上述方法对本品含量进行检测，结果如下：
表6含量测定结果
Table6Testresultsofcontent
批号
含量（%）
20020601
99.1
20020602
99.0
20020603
99.2
对照品及样品溶液色谱图如图4-7。
图4对照溶液色谱图
Fig.4Chromatogramofreferencesubstance
图520020601样品溶液色谱图
Fig.5Chromatogramofsample20020601
图620020602样品溶液色谱图
Fig.6Chromatogramofsample20020602
图720020603样品溶液色谱图
Fig.7Chromatogramofsample20020603
4结论
本实验采用已确定的HTLP条件测定阿德福韦酯的含量，并对该品线性、准确性、重现性、最低检出限进行研究。
在该HTLP条件下，所测结果令人满意。
此方法检测结果准确，重现性好，完全适用于阿德福韦酯含量的检测。
参考文献：
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HTLPDeterminationofAdefovirDipivoxilContent
Abstract：
Objevtive:
ToestablishanmethodfordeterminingAdefovirDipivoxilbyHTLP.Methods:
AnhighperformanceliquidchromatographywithUVdetectionwasadopted,thedetectionwavelength:
261nm;Thechromatographiccolumn:
octadecylsilanebondedsilicagelcolumn（5μm,250mm×4.6mm）;Mobilephase:
0.02mol/Lpotassiumdihydrogenphosphate-acetonitrile（PHwasadjustedto6.0using0.1mol/LSodiumhydroxide）（60:
40）;Flowrate:
1.0mL/min;Thecolumntemperature:
25℃；Injectionvolume:
20uL.Results:
Thecalibrationcurvewaslinearintherangeof0.0206～0.1032mg/mL（r=0.9997）,therecoveriesofarbidolwas99.89%,andtheRSDwas0.14%.Conclusion:
Testresultsofthismethodareaccurate,ithasgoodreproducibility,anditiscompletelysui
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