四季金果 医学分子生物学要点.docx

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四季金果医学分子生物学要点

原核生物基因组结构与功能的特点

1.基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。

其DNA是与蛋白质结合，但并不形成染色体结构，只是习惯上将之称为染色体。

细菌染色体DNA在胞内形成一个致密区域，即类核（nucleoid），类核无核膜将之与胞浆分开。

2.基因组中只有1个复制起点。

3.具有操纵子结构。

操纵子（operon）是指数个功能相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动和操纵区）及其下游的转录终止信号构成的基因表达单位。

4.结构基因无重叠现象，基因组中任何一段DNA不会用于编码2种蛋白质。

5.基因序列是连续的，无内含子结构。

6.编码区和非编码区（主要是调控序列）在基因组中约各占50%。

7.基因组中的重复序列很少。

编码蛋白质结构基因多为单拷贝，但编码rRNA的基因往往是多拷贝的，这有利于核糖体的快速组装。

（15AA/秒，2AA/秒）

8.具有编码同功酶的基因（isogene）这是一类结构不完全相同，而功能相同的基因。

如E.coli含有2个编码乙酸乳酸合成酶的基因和2个编码分支酸变位酶同工酶的基因。

9.细菌基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。

10.原核基因的基本结构特点：

启动子（promoter）、操纵基因（operator）、调控序列、结构基因（structuregene）、终止子（terminator）。

真核基因的基本结构

1.结构基因、内含子和外显子、断裂基因。

（1）结构基因（structuralgene）指能转录成为mRNA、rRNA或tRNA的DNA序列。

（2）内含子和外显子真核生物的结构基因是不连续的，编码序列被非编码序列打断，在编码序列之间的序列称为内含子（intron），编码序列称为外显子（extron）。

（3）断裂基因（splitgene）在真核的结构基因组中，编码顺序被许多称为内含子的非编码区分割成几段称之。

病毒基因组

基因组（genome）1个配子（精子或卵子），1个单倍体细胞或1个病毒所包含的全套基因。

病毒核酸或为DNA或为RNA，可以统称为病毒染色体。

完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不受核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。

类病毒例外，它是一类植物病毒，为很小的单链闭环RNA（250-400碱基）。

病毒核酸与所有的原、真核生物的核酸组比较，最为突出的特点是每种病毒颗粒只含1种核酸，或DNA或RNA，两者不共存于1种病毒颗粒中，据此，病毒可以分成两组，即DNA病毒和RNA病毒。

病毒核酸分子量大小：

RNA病毒小106-107D，DNA病毒大；107-108D

基因数：

3-几百个

病毒基因组结构功能特点

（一）病毒核酸可以是ssDNA、dsDNA或RNA分子，分子结构有发夹、环状、线型、节段型。

以SSDNA,dsRNA最为突出。

（二）基因重叠即同一段基因可以编码2种或以上的基因产物这种现象在其它生物细胞仅见于线粒体和质粒DNA.所以是病毒核酸较为独特结构，能使小小病毒携带较多的遗传信息，原因是病毒基因阅读框可以错位（SV40）。

（三）连续的和不连续的基因病毒基因结构特征往往与其宿主细胞基因结构相似。

原核病毒（如噬菌体）基因是连续的，没有内含子；

真核病毒（如多瘤病毒）基因是不连续的，有内含子。

有意思的是，有些真核病毒的内含子或其中的一部分对某一基因来说是内含子，对另一基因却是外显子。

如SV40和多瘤病毒的早期区域就是这样的。

除了（+）RNA病毒外，真核病毒基因都是先转录成mRNA前体，再经过剪接等步骤能成为成熟的mRNA.

（四）节段性基因大部分病毒核酸都是由一条双链或单链构成，少数病毒核酸由数个片段构成。

这类病毒一般是RNA病毒。

如flu-v由6-7个片段构成，各段在天然状态下不连接，而且可以转录成6-7个片段相应的mRNA。

单独的片段没有感染性，要一起感染才发挥作用。

（五）除了retro-v外，所有的病毒基因都是单倍体基因。

即每个基因在某个病毒颗粒中只出现一次，即只有1套基因。

（六）编码区>非编码区（95%/5%）。

病毒核酸大多数顺序都用来编码蛋白质。

（七）基因常常成簇排列，没有间隔序列或间隔序列很小。

功能相关蛋白质基因在基因组的1个或几个特定部位，丛集成簇被转录成多顺反子，然后加工成各种蛋白质的mRNA模板。

如腺病毒晚期基因。

（八）不规则的结构基因

1.几个结构基因的编码区不规则，因此有些结构基因无翻译起始序列。

2.有的mRNA（=gene）没有5’帽子，但有翻译增强子。

（九）DNA或RNA1种病毒基因组只有1种核酸。

乳糖操纵子调节机制

色氨酸操纵子的调节机制

v色氨酸操纵子（trpoperon）：

v阻遏型操纵子；

v主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。

v当细胞内缺乏色氨酸时，此操纵子开放；

v而当细胞内合成的色氨酸过多时，此操纵子被关闭。

在高浓度色氨酸存在下，通过形成特殊的“衰减子”结构，对转录进行更精细的调控。

前导trpL序列可分为四个部分，1与2，2与3，3与4之间均能相互配对。

衰减作用对Trp转录的调控就是通过1、2、3、4部分之间互补配对形成不同的二级结构而实现的，而上级结构的形成又取决于核糖体对衰减序列的翻译速度。

（1）当细胞中有色氨酸存在时，核糖体能够顺利地翻译出前导肽而在终止密码子UAG处停下来。

这时核糖体占据了序列1和部分序列2，使序列2和序列3不能产生有效配对，因而序列3和序列4配对而产生终止子和发夹结构。

（2）当出现Trp饥饿时，核糖体停顿在两个Trp密码子上，这时核糖体占据序列1，序列2与序列3配对。

这样，当序列4转录出来后仍呈单链状态，不能形成终止的发夹结构，于是转录继续进行下去。

真核基因表达调控的特点

（一）DNA、染色体水平的变化特点

1．对核酸酶极度敏感

2．DNA拓朴结构变化

天然双链DNA几乎均以负性超螺旋构象存在。

当基因激活后，则转录区前方的DNA拓朴结构变为正性超螺旋，有利于RNA聚合酶向前移动，进行转录。

3.DNA甲基化

DNA甲基化程度与基因表达呈反比。

4．染色体结构的变化

蛋白发生修饰，碱基暴露等原因而引起核小体结构改变，使核小体不稳定性增加。

（二）RNA聚合酶、mRNA的转录激活及调节

真核生物有3种RNA聚合酶：

RNApolⅠ、Ⅱ、Ⅲ。

每种RNA聚合酶由约10个亚基组成，其中TATA盒结合蛋白（TBP）为3种酶共有。

RNApolⅡ对催化mRNA的生成起主要作用。

转录前RNApolⅡ必须与TBP、TFⅡD等各种通用转录因子形成转录前复合体（PIC），从而激活或抑制RNA的转录。

（三）正性调节占主导

真核基因一般都处于阻遏状态，RNA聚合酶对启动子的亲和力很低。

通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。

采用正性调节机制更有效、经济、特异；

（四）转录和翻译过程分开进行

转录与翻译过程分别存在于不同的亚细胞部位（胞核与胞浆），可分别进行调控。

（五）转录后加工

真核基因大多为断裂基因，内含子和外显子一起被转录。

转录后产物（hnRNA）经剪接、加帽、加尾等加工修饰，才能转变为成熟的mRNA。

离子通道受体的典型代表－乙酰胆碱受体的结构模式

⏹离子通道受体是一类自身为离子通道的受体，它们的开关受化学配体（主要为神经递质）的控制，又称为配体门受体型离子通道（ligang-gatedreceptorchannel）.

⏹离子通道受体信号转导的最终作用是导致细胞膜电位改变，通过将化学信号转变成电信号而影响细胞功能。

⏹离子通道受体可以是阳离子通道（如乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺）或阴离子通道（如甘氨酸、γ－氨基丁酸）受体，差别在于构成亲水性通道的氨基酸不同。

乙酰胆碱受体是由5个同源性很高的亚基构成，包括2个α亚基，1个β亚基，1个γ亚基的和1个δ亚基。

每一个亚基都是一个四次跨膜蛋白，分子量约60kd，约由500个氨基酸残基构成。

推测跨膜部分为四条α螺旋结构，其中一条α螺旋含较多的极性氨基酸，就是由于这个亲水区的存在，使五个亚基共同在膜中形成一个亲水性的通道。

乙酰胆碱的结合部位位于α亚基上。

两分子乙酰胆碱的结合可以使之处于通道开放构象，但即使有乙酰胆碱的结合，该受体处于通道开放构象状态的时限仍十分短暂，在几十毫微秒内又回到关闭状态。

然后乙酰胆碱与之解离，受体则恢复到初始状态，做好重新接受配体的准备。

G蛋白偶联受体的信号转导

⏹GTP结合蛋白（GTPbindingprotein）亦称鸟苷酸结合蛋白，简称G蛋白。

⏹G蛋白包括两类：

第一类为异源三聚体Ｇ蛋白（a、b、g亚基），位于细胞膜，可与Ｇ蛋白偶联受体结合；

第二类为小分子单体Ｇ蛋白，21kD。

Ras是最早发现的小分子Ｇ蛋白，因此这一类蛋白被称为Ras超家族，也称为Ras样GTP酶，成员已超过50种。

G蛋白是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由α、β、γ三个亚基组成。

有两种构象：

非活化型；活化型

G蛋白是一类非常重要的信号转导分子，在各种细胞信号转导途径中，G蛋白起开关作用（通过GTP/GDP的转换）。

当其结合GTP时为活化形式，使下游信号转导途径开放；当其结合水解的GDP（G蛋白自身具有GTP酶活性）时为非活化状态，下游信号关闭。

G蛋白偶联受体（G-proteincoupledreceptors,GPCRs）又称七个跨膜α螺旋受体/蛇型受体（serpentinereceptor）

G蛋白偶联受体特点：

⏹N端在胞外，C端在胞内

⏹中间段形成七个跨膜螺旋结构、三个胞外环和三个胞内环

⏹其中胞内第三个环偶联鸟苷酸结合蛋白（guanylatebindingprotein，简称G蛋白）

G蛋白偶联受体的信号传递的基本过程包括：

①配体受体结合；

②受体活化G蛋白；

③G蛋白激活或抑制效应分子；

④效应分子改变第二信使（如腺甘酸环化酶AC）的含量与分布；

⑤第二信使作用于靶分子，改变其构象，导致靶基因的转录表达及其细胞的应答反应。

整个信号转导过程包括以下三大步：

①G蛋白的循环或活化（Gproteincycle）

②效应分子活化和细胞内信使水平改变

③细胞内信使的靶分子的活化

表皮生长因子受体介导的信号转导途径

⏹表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）是一分子量为6000道尔顿的多肽，在血液及其它多种组织中均有分布。

EGF具有多种功能，例如，促进创伤后的表皮恢复等。

EGF受体（EGFR）是一种典型的蛋白酪氨酸激酶受体，由1186个氨基酸残基组成，分子量约170KD。

该受体途径一直被作为生长因子受体介导的信号转导机理的一个模型系统加以研究，并获得突破性进展，EGFR信号在细胞内的大致传递过程得到阐明。

EGFR-Ras-MAPK这一信号转导途径的发现是九十年代中分子生物学的重要进展之一。

EGFR信号传递过程主要包括以下几大步骤：

⏹

（一）受体二聚体的形成及其磷酸化

⏹EGF与受体的结合使受体发生二聚体化，从而改变受体的构象，其自身具有的蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的数个酪氨酸残基在自身激酶的作用下发生磷酸化。

⏹

（二）募集接头蛋白Grb2磷酸化的受体

一方面进一步增强其自身激酶活性，另一方面，创造了与含SH2结构域的蛋白分子结合的条件，因为SH2结构域可与受体分子上的磷酸化的酪氨酸残基结合。

Grb2（growthfactorbingprotein）是一种由1个SH2结构域和2个SH3结构域构成的分子，它作为接头，一边与上游分子受体结合，一边与下游分子SOS（sonofsevenless）结合。

⏹（三）低分子量G蛋白ras的调控分子--SOS的活化SOS是GEF（GTPexchangefactor）家族的成员，是低分子量G蛋白的活性调节分子。

它可以促进Ras蛋白GTP交换能力，增加GTP结合形式的Ras，从而增加了活化形式的Ras的数量，对下游信号具有正向调控作用。

SOS含有可以与SH3结构域相结合的富含脯氨酸基序，当Grb2结合到磷酸化的EGFR后，它的两个SH3结构域即可结合于SOS，使SOS活化。

⏹（四）低分子量G蛋白Ras的活化活化的SOS发挥其对Ras分子的GTP结合的促进作用，使Ras进入激活状态。

活化的Ras则可以作用于其下游分子-Raf，使之活化。

Raf是MAPK级联反应的最上游分子，由此启动了MAPK系统的三级级联激活过程。

⏹（五）MAPK的级联激活Raf是一种MAPKKK,它作用于MEK（属于MAPKK），使之磷酸化并活化。

活化的MEK再作用于属于MAPK家族的ERK1,使之磷酸化并活化，由此完成了MAPK的三级激活过程。

⏹（六）转录因子的磷酸化及其转录调控作用活化的ERK可以转位至细胞核内。

某些转录调控因子（如Fos、Elk和Myc等）是ERK的底物，在ERK作用下发生磷酸化。

磷酸化的转录因子将作用于相应靶基因的上游激活序列，从而改变相应基因的转录速度，影响基因表达水平，起到对细胞的生长状态进行调节的作用。

上述Ras-MAPK途径是EGFR的主要信号途径之一。

需要指出的是,EGFR分子结构中具有多个酪氨酸残基，除了Grb2分子外，还可以募集其它含有SH2结构域的信号转导分子，形成另外的信号转导途径支路。

这些途径之间存在着相互交叉并形成一个调控网络。

γ－干扰素受体介导的细胞转导途径

⏹γ－干扰素是由活化T淋巴细胞产生的，它具有促进抗原提呈和特异性免疫识别的作用，并可促进B淋巴细胞分泌抗体。

γ－干扰素受体结合配体以后，发生受体二聚体化，二聚体化的受体可以募集JAK（JanusKinase）分子结合于受体上，使JAK活化，活化的JAK催化受体发生酪氨酸磷酸化，受体分子上的磷酸化酪氨酸是一类信号分子STAT（转录信号转导物与激活物signaltransducerandactivatoroftranscription）SH2的识别和结合位点，STAT与受体结合后亦发生酪氨酸的磷酸化，酪氨酸磷酸化的STAT形成二聚体并进入胞核。

二聚体STAT分子作为有活性的转录因子，直接影响相关基因的表达，进而改变靶细胞的增殖或分化状态。

目前把JAK-STAT-转录调控这一相对独立和具有特征性的途径称为JAK-STAT通路。

JAK即JanusKinase（两面神激酶）,是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶（PTK）。

该族成员有7个同源区（JH1~7）,其中JH1区为激酶区,JH2区为伪激酶区。

与其它PTK不同,JAK内无Src同源区2（SH2）结构,因其既能催化与之相连的细胞因子受体发生酪氨酸磷酸化,又能磷酸化多种含特定SH2区的信号分子从而使其激活,故称之为Janus-罗马神话中前后各有一张脸的门神。

重组DNA技术

⏹重组DNA技术又称为基因工程（geneticengineering）或分子克隆（molecularcloning）。

基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：

⏹①载体和目的基因的分离；

⏹②载体和目的基因的切断；

⏹③载体和目的基因的重组；

⏹④重组DNA的转化和扩增；

⏹⑤重组DNA的筛选和鉴定。

①－1载体：

基因工程中常用的载体（vector）主要包括质粒（plasmid）、噬菌体（phage）和病毒（virus）三大类。

这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

①－1－1质粒：

是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。

最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。

①－1－2噬菌体：

可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。

常用的为人工构建的λ噬菌体载体。

噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。

目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。

①－1－3病毒：

常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。

目前应用相对较少。

利用PCR合成：

如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链应（polymerasechainreaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。

但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。

聚合酶链式反应，其英文PolymeaseChainReaction（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

PCR技术的基本原理：

无细胞分子克隆法：

在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。

PCR技术的特点：

1）高度的灵敏性2）特异性3）操作简便易行4）用途广泛

PCR工作步骤

　　1.DNA变性（90℃-96℃）：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

　　2.退火（复性）（25℃-65℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

　　3.延伸（68℃-75℃）：

在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

4循环次数：

主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次，次数过多：

扩增效率降低以及错误掺入率增加。

重组DNA的筛选和鉴定

（一）根据重组体的表型进行筛选：

对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。

如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。

在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。

（二）根据标志互补进行筛选：

当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。

即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。

（三）根据DNA限制酶谱进行分析：

经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。

将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。

（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：

为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。

目的基因的检测与鉴定

检测与鉴定的目的：

目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性

（一）检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上

（二）检测目的基因是否转录出了mRNA

（三）检测目的基因是否翻译成蛋白质

第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；

第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；

第三步，从转基因生物中提取蛋白质，凝胶电泳；

第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；

第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。

由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。

如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。

分子杂交与印迹技术

1、DNA印迹技术（Southernblotting）

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。

2、RNA印迹技术（Northernblotting）

用于RNA的定性定量分析。

3、蛋白质的印迹分析（Westernblotting）

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

其他技术:

斑点印迹（dotblotting）

原位杂交（insituhybridization）

DNA点阵（DNAarray）

DNA芯片技术（DNAchip）

1-1DNA印迹技术：

又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析，是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

Southern杂交的主要步骤：

⏹待测DNA样品的制备、酶切

⏹待测DNA样品的电泳分离：

琼脂糖凝胶电泳

⏹凝胶中DNA的变性：

碱变性

⏹Southern转膜：

⏹硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜

⏹毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法

⏹探针的制备

⏹Southern杂交

⏹杂交结果的检测

Southern杂交的基本方法

⏹将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；

⏹经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。

⏹附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影确定与探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

2-1RNA印迹技术

⏹又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。

是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。

⏹主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。

3-1蛋白质印迹技术

⏹又称为Western杂交，或免疫印迹技术（immunobloting）。

即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。

⏹应用：

用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

⏹原理：

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

⏹主要步骤：

⏹蛋白样品的制备

⏹经过SDS-PAGE分离的样品

⏹分离的蛋白转移到膜载体上，转移后将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附

⏹用固定在膜上的蛋白作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合

⏹洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性标记的二抗，通过显色或放射自显影来检测蛋白。

区别：

Southern和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程有区别，主要是：

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