沙门氏菌检测.docx

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沙门氏菌检测

1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1.1冰箱：

2℃～5℃。

1.2恒温培养箱：

36℃±1℃，42℃±1℃。

1.3均质器。

1.4振荡器。

1.5电子天平：

感量0.1g。

1.6无菌锥形瓶:

容量500ml，250ml。

1.7无菌吸管：

1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。

1.8无菌培养皿：

直径90mm。

1.9无菌试管：

3mm×50mm、10mm×75mm。

1.10无菌毛细管。

1.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。

1.12全自动微生物生化鉴定系统。

2培养基和试剂

2.1缓冲蛋白胨水（BPW）：

见附录中1。

2.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：

见附录中2。

2.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：

见附录中3。

2.4亚硫酸铋（BS）琼脂：

见附录中4。

2.5HE琼脂：

见附录中5。

2.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：

见附录中6。

2.7沙门氏菌属显色培养基。

2.8三糖铁（TSI）琼脂：

见附录中7。

2.9蛋白胨水、靛基质试剂：

见附录中8。

2.10尿素琼脂（pH7.2）：

见附录中9。

2.11氰化钾（KCN）培养基：

见附录中10。

2.12赖氨酸脱羧酶试验培养基：

见附录中11。

2.13糖发酵管：

见附录中12。

2.14邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：

见附录中13。

2.15半固体琼脂：

见附录中14。

2.16丙二酸钠培养基：

见附录中15。

2.17沙门氏菌O和H诊断血清。

2.18生化鉴定试剂盒。

3操作方法

3.1试验前准备

3.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。

准备好足够用量，避免操作中出入操作间。

3.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。

3.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。

3.1.4操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。

3.2前增菌

称取25g（ml）样品放入盛有225mlBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mlBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。

若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。

如需测定pH值，用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。

无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。

如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。

3.3增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10mlTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。

同时，另取1ml，转种于10mlSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。

3.4分离

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。

于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。

各个平板上的菌落特征见表1。

表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板

沙门氏菌

BS琼脂

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

HE琼脂

蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。

XLD琼脂

菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。

沙门氏菌属显色培养基

按照显色培养基的说明进行判定。

3.5生化试验

3.5.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。

在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

＋（－）

＋

可疑沙门氏菌属

＋（－）

－

可疑沙门氏菌属

＋（－）

＋

可疑沙门氏菌属

＋/－

－

非沙门氏菌

＋/－

非沙门氏菌

注：

K：

产碱，A：

产酸，＋：

阳性，－：

阴性；＋（－）多数阳性，少数阴性；＋/－：

阳性或阴性。

3.5.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。

于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。

将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号

硫化氢（H2S）

靛基质

pH7.2尿素

氰化钾（KCN）

赖氨酸脱羧酶

＋

－

＋

－

＋

－

＋/－

注：

＋：

阳性，－：

阴性，＋/－：

阳性或阴性。

3.5.2.1反应序号A1：

典型反应判定为沙门氏菌属。

如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。

如有2项异常为非沙门氏菌。

表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH7.2尿素

氰化钾（KCN）

赖氨酸脱羧酶

判定结果

－

甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）

－

＋

沙门氏菌IV或V（要求符合本群生化特性）

＋

－

＋

沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）

注：

＋：

阳性，－：

阴性。

3.5.2.2反应序号A2：

补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

3.5.2.3反应序号A3：

补做ONPG。

ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性。

甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

3.5.2.4必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表5沙门氏菌属各生化群的鉴别

项目

III

卫矛醇

＋

－

＋

－

山梨醇

＋

－

水杨苷

－

＋

－

ONPG

－

＋

－

＋

－

丙二酸盐

－

＋

－

KCN

－

＋

－

注：

＋：

阳性，－：

阴性。

3.5.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据3.5.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

3.6血清学鉴定

3.6.1抗原的准备

一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2次，自远端取菌培养后再检查。

3.6.2多价菌体抗原（O）鉴定

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。

再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。

将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

3.6.3多价鞭毛抗原（H）鉴定同3.6.2。

3.7结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。

附录培养基和试剂

1缓冲蛋白胨水（BPW）

1.1成分

蛋白胨10.0g

氯化钠5.0g

磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0g

磷酸二氢钾1.5g

蒸馏水1000ml

pH7.2±0.2

1.2制法

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min。

2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液

2.1基础液

蛋白胨10.0g

牛肉膏5.0g

氯化钠3.0g

碳酸钙45.0g

蒸馏水1000ml

pH7.0±0.2

除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121℃，20min。

2.2硫代硫酸钠溶液

硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0g

蒸馏水加至100ml

高压灭菌121℃，20min。

2.3碘溶液

碘片20.0g

碘化钾25.0g

蒸馏水加至100ml

将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。

2.40.5％煌绿水溶液

煌绿0.5g

蒸馏水100ml

溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。

2.5牛胆盐溶液

牛胆盐10.0g

蒸馏水100ml

加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121℃，20min。

2.6制法

基础液900ml

硫代硫酸钠溶液100ml

碘溶液20.0ml

煌绿水溶液2.0ml

牛胆盐溶液50.0ml

临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。

3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液

3.1成分

蛋白胨5.0g

乳糖4.0g

磷酸氢二钠10.0g

亚硒酸氢钠4.0g

L-胱氨酸0.01g

蒸馏水1000ml

pH7.0±0.2

3.2制法

除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10ml（称取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15ml，使溶解，再加无菌蒸馏水至100ml即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。

摇匀，调节pH。

4亚硫酸铋（BS）琼脂

4.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉膏5.0g

葡萄糖5.0g

硫酸亚铁0.3g

磷酸氢二钠4.0g

煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0ml

柠檬酸铋铵2.0g

亚硫酸钠6.0g

琼脂18.0g～20g

蒸馏水1000ml

pH7.5±0.2

4.2制法

将前三种成分加入300ml蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20ml和30ml蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和30ml蒸馏水中，琼脂加入600ml蒸馏水中。

然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。

冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。

将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。

调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃～55℃。

加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。

注：

本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。

5HE琼脂（HektoenEntericAgar）

5.1成分

蛋白胨12.0g

牛肉膏3.0g

乳糖12.0g

蔗糖12.0g

水杨素2.0g

胆盐20.0g

氯化钠5.0g

琼脂18.0g～20.0g

蒸馏水1000ml

0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0ml

Andrade指示剂20.0ml

甲液20.0ml

乙液20.0ml

pH7.5±0.2

5.2制法

将前面七种成分溶解于400ml蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600ml蒸馏水内。

然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。

加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。

再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃～55℃倾注平皿。

注:

①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。

②甲液的配制

硫代硫酸钠34.0g

柠檬酸铁铵4.0g

蒸馏水100ml

③乙液的配制

去氧胆酸钠10.0g

蒸馏水100ml

④Andrade指示剂

酸性复红0.5g

1mol/L氢氧化钠溶液16.0ml

蒸馏水100ml

将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。

数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1ml～2ml。

6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂

6.1成分

酵母膏3.0g

L-赖氨酸5.0g

木糖3.75g

乳糖7.5g

蔗糖7.5g

去氧胆酸钠2.5g

柠檬酸铁铵0.8g

硫代硫酸钠6.8g

氯化钠5.0g

琼脂15.0g

酚红0.08g

蒸馏水1000ml

pH7.4±0.2

6.2制法

除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。

另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。

将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平皿。

注:

本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。

本培养基宜于当天制备，第二天使用。

7三糖铁（TSI）琼脂

7.1成分

蛋白胨20.0g

牛肉膏5.0g

乳糖10.0g

蔗糖10.0g

葡萄糖1.0g

硫酸亚铁铵（含6个结晶水）0.2g

酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0ml

氯化钠5.0g

硫代硫酸钠0.2g

琼脂12.0g

蒸馏水1000ml

pH7.4±0.2

7.2制法

除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。

另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。

将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2ml～4ml，高压灭菌121℃10min或115℃15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。

8蛋白胨水、靛基质试剂

8.1蛋白胨水

蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g

氯化钠5.0g

蒸馏水1000ml

pH7.4±0.2

将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121℃高压灭菌15min。

8.2靛基质试剂

8.2.1柯凡克试剂：

将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25ml。

8.2.2欧-波试剂：

将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95％乙醇内。

然后缓慢加入浓盐酸20ml。

8.3试验方法

挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。

加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注：

蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。

每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

9尿素琼脂（pH7.2）

9.1成分

蛋白胨1.0g

氯化钠5.0g

葡萄糖1.0g

磷酸二氢钾2.0g

0.4％酚红3.0ml

琼脂20.0g

蒸馏水1000ml

20%尿素溶液100ml

pH7.2±0.2

9.2制法

除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。

另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。

将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121℃高压灭菌15min。

冷至50℃～55℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。

尿素的最终浓度为2％。

分装于无菌试管内，放成斜面备用。

9.3试验方法

挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h，观察结果。

尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

10氰化钾（KCN）培养基

10.1成分

蛋白胨10.0g

氯化钠5.0g

磷酸二氢钾0.225g

磷酸氢二钠5.64g

蒸馏水1000ml

0.5％氰化钾20.0ml

10.2制法

将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121℃高压灭菌15min。

放在冰箱内使其充分冷却。

每100ml培养基加入0.5％氰化钾溶液2.0ml（最后浓度为1:

10000），分装于无菌试管内,每管约4ml,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。

同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。

10.3试验方法

将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾（KCN）培养基。

并另挑取1环接种于对照培养基。

在36℃±1℃培养1d～2d，观察结果。

如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制）。

注:

氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。

夏天分装培养基应在冰箱内进行。

试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。

试验时对每一环节都要特别注意。

11赖氨酸脱羧酶试验培养基

11.1成分

蛋白胨5.0g

酵母浸膏3.0g

葡萄糖1.0g

蒸馏水1000ml

1.6％溴甲酚紫-乙醇溶液1.0ml

L-赖氨酸或DL-赖氨酸0.5g/100ml或1.0g/100ml

pH6.8±0.2

11.2制法

除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸。

L-赖氨酸按0.5％加入，DL-赖氨酸按1％加入。

调节pH。

对照培养基不加赖氨酸。

分装于无菌的小试管内，每管0.5ml，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。

11.3试验方法

从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃±1℃培养18h～24h，观察结果。

氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。

阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。

对照管应为黄色。

12糖发酵管

12.1成分

牛肉膏5.0g

蛋白胨10.0g

氯化钠3.0g

磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.0g

0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.0ml

蒸馏水1000ml

pH7.4±0.2

12.2制法

12.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。

按0.5％加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。

12.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100ml，121℃高压灭菌15min。

另将各种糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌。

将5ml糖溶液加入于100ml培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：

蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

12.3试验方法:

从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养,一般2d～3d。

迟缓反应需观察14d～30d。

13ONPG培养基

13.1成分

邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）60.0mg

0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）10.0ml

1％蛋白胨水（pH7.5）30.0ml

13.2制法

将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5ml，用橡皮塞塞紧。

13.3试验方法

自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36℃±1℃培养1h～3h和24h观察结果。

如果β-半乳糖苷酶产生，则于1h～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。

14半固体琼脂

14.1成分

牛肉膏0.3g

蛋白胨1.0g

氯化钠0.5g

琼脂0.35g～0.4g

蒸馏水100ml

pH7.4±0.2

14.2制法

按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。

分装小试管。

121℃高压灭菌15min。

直立凝固备用。

注:

供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。

15丙二酸钠培养基

15.1成分

酵母浸膏1.0g

硫酸铵2.0g

磷酸氢二钾0.6g

磷酸二氢钾0.4g

氯化钠2.0g

丙二酸钠3.0g

0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.0ml

蒸馏水1000ml

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