最新版微生物限度测定操作规程.docx

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最新版微生物限度测定操作规程

文件编号：

版本：

A/0

主管部门：

质检部

发放号：

ABC药品有限公司

药品生产质量管理体系

质量控制文件

微生物限度测定操作规程

2019年最新版

编制:

日期:

审核:

日期:

批准:

日期:

发放范围：

公司各部门2020年01月01日生效

目的：

建立一个微生物限度测试操作规程。

范围：

药品及原料检测。

责任：

检验员、质检科长、质保科长、质量总监。

依据：

《中华人民共和国药典》2000年版

内容：

微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。

包括染菌量及控制菌的检查。

供试品应随机抽样。

一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。

检查的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。

除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。

检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。

培养基及其制备方法

除另有规定外，培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。

1　营养琼脂培养基与营养肉汤培养基

1.1营养琼脂培养基

胨　　　　10g　　　肉浸液　　1000ml氯化钠　　5g

取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

2　玫瑰红钠琼脂培养基

胨5g玫瑰红钠0.0133g

葡萄糖10g　　　　　　琼脂　　　　　15～20g

磷酸二氢钾　　1g　　　　　　水　　　　　　1000ml

硫酸镁　　　　0.5g

除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、

玫瑰红钠，分装，灭菌。

3　酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）

胨10g葡萄糖20g

水1000ml酵母浸出粉5g

琼脂15～20g

除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。

4　胆盐乳糖培养基（BL）

胨20g磷酸氢二钾（K2HPO4）4.0g水1000ml

乳糖5g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.3g

氯化钠5g牛胆盐（或去氧胆酸钠0.5g）2g

除乳糖、牛胆盐外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节PH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。

5　曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）

营养琼脂培养基100ml曙红钠指示液2ml

20%乳糖溶液　5ml亚甲蓝指示液1.3～1.6ml

取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其它3种溶液，摇匀，倾注平皿。

6　麦康凯琼脂培养脂（MacC）

胨20g氯化钠5g琼脂15～20g

乳糖10g1%中性红指示液3ml水1000ml

牛胆盐5g

除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌。

冷至约60℃，倾注平皿。

74-甲基伞形酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide,MUG）培养基

胨　10g　磷酸二氢钾0.9g　　　　氯化钙50mg

硫酸铵5g磷酸氢二钠（无水）6.2g　　氯化钠10g

硫酸锰0.5mg亚硫酸钠40mg　　　　水1000ml

硫酸锌0.5mg去氧胆酸钠1g

硫酸镁0.1g　MUG75mg

除MUG外，各成分溶解于1000ml水中，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解后，每管分装5ml，115℃灭菌20分钟。

8　三糖铁琼脂培养基（TSI）

胨　20g葡萄糖1g0.2%酚磺酞指示液12.5ml

牛肉浸出粉5g氯化钠5g琼脂　　12～15g

乳糖　10g硫酸亚铁0.2g水　1000ml

蔗糖　10g硫代硫酸钠0.2g

除三糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层（2～3cm）短斜面。

9　四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）

胨5g碳酸钙10g水1000ml

牛胆盐1g硫代硫酸钠30g

取上述成分，混合，微温使溶解，灭菌。

临用前，取上述培养基，每10ml加入碘溶液（取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中）0.2ml和0.1%亮绿试液0.1ml，混匀。

10　沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS）

胨5g硫代硫酸钠8.5g牛肉浸出粉5g

乳糖10g中性红指示液2.5ml亮绿试液0.33ml

牛胆盐8.5g琼脂20g枸椽酸铁铵1g

枸椽酸钠8.5g水1000ml

除乳糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。

11　胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）

胨20g去氧胆酸钠1g中性红溶液3ml

牛肉浸出粉3g硫代硫酸钠2.3g琼脂18-20g

乳糖10g枸橼酸钠1g水1000ml

蔗糖10g枸橼酸铁铵1g

除糖、指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。

12　溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

胨10g氯化钠5g琼脂15-20g

牛肉浸出粉3g溴化十六烷基三甲铵0.3g水1000ml

除琼脂外，取上述成分,混合，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为7.5±0.1,加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。

13　亚碲酸盐肉汤培养基

临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1%亚碲酸钠（钾）溶液0.2ml，混匀，即得。

14　卵黄氯化钠琼脂培养基

胨6g氯化钠30g琼脂23g

牛肉浸出粉1.8g10%氯化钠卵黄液100ml水650ml

除10%氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为7.6±0.1，灭菌，待冷至约60℃，以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液，充分振摇，倾注平皿。

10%氯化钠卵黄液的制备取新鲜鸡蛋一个，以无菌操作取出卵黄，放入10%灭菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。

15　甘露醇氯化钠琼脂培养基

胨10g氯化钠75g琼脂15-20g

牛肉浸出粉1g酚磺酞指示液2.5ml水1000ml

甘露醇10g

除甘露醇、酚磺酞指示液及琼脂外，取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。

16　蛋白胨水培养基

胰蛋白胨10g氯化钠5g水1000ml

取上述成分混合，加热溶化，调节PH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。

17　磷酸盐葡萄糖胨水培养基

胨7g葡萄糖5g

磷酸氢二钾（K2HPO4）3.8g水1000ml

取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌15分钟。

18　枸橼酸盐培养基

氯化钠5g枸橼酸钠（无水）2g

硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g溴麝香草酚蓝指示液20ml

磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g琼脂15-20g

磷酸二氢铵（NH4H2PO4）1g水1000ml

除溴麝香草酚蓝指示液和琼脂外，取上述成分,混合，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热溶化，加入指示剂，混匀。

分装于小试管，灭菌，置成斜面。

注：

所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。

19　糖、醇发酵培养基

基础液胨10g0.5%酸性品红指示液10ml

糖、醇0.5%（或溴麝香草酚蓝指示液6ml）

氯化钠5g水1000ml

取胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4，加入指示剂混匀，分装每瓶100ml，121℃灭菌15分钟。

配制葡萄糖发酵培养基时，于100ml基础液加入0.5g葡萄糖，分装于含杜氏管（Durham）的小试管中，121℃灭菌15分钟。

配制其它糖、醇发酵培养基时，将各种糖、醇分别配成10%溶液，与基础液同时于121℃灭菌15分钟。

以无菌操作将5ml糖、醇溶液加入100ml基础液内，分装于灭菌小试管中。

注：

糖、醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。

20　脲（尿素）琼脂培养基

胨1g磷酸二氢钾（KH2PO4）2g琼脂20g

葡萄糖1g0.2%酚磺酞指示液6ml水1000ml

氯化钠5g20%无菌脲溶液100ml

除脲琼脂外，取上述成分，混合，调节PH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化并分装于锥形瓶，灭菌。

冷至50-55℃，加入无菌脲溶液，混匀，分装于灭菌试管中，置成斜面。

21　氰化钾培养基

胨　3g　碳酸二氢钾　　0.225g氰化钾试液　　15ml

氯化钠5g磷酸氢二钠　　5.64g　　　水1000ml

除氰化钾试液外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，灭菌。

冷却后，加入氰化钾试液，分装于12mm×100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡皮塞塞紧，置4℃保存。

同时，以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基，分装于灭菌试管中。

22　赖氨酸脱羧酶试验培养基

胨5g葡萄糖1gL-赖氨酸（DL-赖氨酸）0.5

（1）g

酵母浸出粉3g1.6%溴甲酚紫指示液1ml水1000ml

除赖氨酸外，取上述成分，混合，加热溶解后，加入L-赖氨酸（DL-赖氨酸），调节PH值使灭菌后为6.8，同时以不加赖氨酸培养基作为对照。

分装于灭菌的小试管内，每管2.5ml并滴加一层液体石蜡，121℃灭菌10分钟。

23　绿脓菌素（pyocyanin）测定用培养基（PDP琼脂）

胨20g硫酸钾10g琼脂18-20g

氯化镁（无水）1.4g甘油10ml水1000ml

取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使溶解。

调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀、分装于试管，灭菌，置成斜面。

24　明胶培养基

胨5g明胶120g

牛肉浸出粉3g水1000ml

取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，随时搅拌，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。

25　硝酸盐胨水培养基

胨10g亚硝酸钠0.5g酵母浸出粉3g

水1000ml硝酸钾2g

取胨和酵母浸出粉加入水中，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为7.3±0.1，加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解，混匀，分装于含杜氏管的小试管，灭菌。

试药

牛肉浸出粉Beefextractpowder

本品为米色粉末，在水中溶解。

牛胆盐Oxbilesalt

本品为淡黄色或黄棕色粉末；味苦而甜，具吸湿性，在水和醇中易溶。

玫瑰红钠（四氯四碘荧光素钠）Rosebengal［C20H2Cl4Na2O5=1017.6］

本品为棕红色粉末。

在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，溶液为棕色。

枸橼酸铁铵Ammoniumferriccitrate[C12H22FeN3O14=488.16]

本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易潮解，见光易还原成亚铁。

在水中溶解，在醇和醚中不溶。

胰蛋白胨Tryptone

本品为米黄色粉末，在水中溶解。

液状石蜡Paraffinliquid

本品为无色油状液体。

在水和醇中不溶，能与醚、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油类相混溶。

DL-赖氨酸DL-Lysine[C6H14N2O2=146.19]

本品为白色结晶；极易潮解。

在水中溶解。

L-赖氨酸L-Lysine[C6H14N2O2=146.19]

本品为白色针状结晶，在空气中易吸收二氧化碳。

在水中易溶，在醇中微溶，在醚中不溶。

酸性品红Fuchsinacid[C20H17N3Na2O9S3=585.54]

本品为绿色有金属光泽的颗粒或深红色粉末。

在水中溶解，在醇中不溶。

磷酸二氢铵AmmoniumdihydrogenphosphateNH4H2PO4=115.03]

本品为无色结晶或白色结晶性粉末。

在水中溶解，在乙醇中不溶。

试液

二盐酸二甲基对苯二胺试液取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml，即得。

需新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。

无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含有10ml水的带塞试管中，121℃灭菌20分钟。

玫瑰红钠试液取玫瑰红钠试液0.1g，加水使溶解成75ml。

亚碲酸钠（钾）试液取亚碲酸钠（钾）0.1g，加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。

无菌枸橼酸钠-氯化钠试液取枸橼酸钠0.5g，加0.9%氯化钠溶液10ml，121℃灭菌20分钟。

草酸铵试液取草酸铵1g，加水溶解使成100ml。

亮绿试液取亮绿0.1g，加水100ml使溶解。

氢氧化钾试液取氢氧化钾40g，加水使溶解成100ml。

盐酸试液取盐酸8.4ml，加水稀释至100ml。

а-萘酚乙醇试液取а-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。

氰化钾试液取氰化钾0.5g，加水溶解使成100ml。

氯化三苯四氮唑试液取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解使成10ml。

靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。

稀释剂

0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。

无菌磷酸缓冲液（PH7.2）取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。

指示液

中性红批示液取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。

变色范围pH6.8-8.0（红→黄）

甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。

亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。

酚磺酞指示液取亚甲蓝0.5g，加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。

变色范围pH6.8～8.4（黄→红）。

溴甲酚紫指示液取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇溶解使成100ml。

变色范围pH5.2-6.8（黄→紫）。

溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。

变色范围pH6.0-7.6（黄→蓝）

酸性品红指示液（Andrade指示）取酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加入1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第2滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。

变色范围pH6.0-7.4（黄→红）

供试品的检验量

每批供试品检验量一般为10g或10ml。

化学药膜剂为100cm2，贵重的或微量包装的供试品检

验量可以酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。

供试品均须取自2个以上的包装

单位，大蜜丸、膜剂除须取自2个以上包装单位外，应取自4丸（片）以上样品。

供试液的制备按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。

1　液体供试品取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。

油剂可加适量聚山梨酯80；气雾剂以适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王浆或蜂蜜者，下同）与滴眼剂可用供试品作为供试液。

2　固体、半固体或粘稠液供试品称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀后，作为供试液。

在制备过程中，必要时可加适量吐温-80，并适当加温，但不应超过45℃。

（1）非水溶性供试品取供试品5g（5ml），加入含溶化的无菌司盘805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶液约80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1∶20）。

（2）不溶于水的膜剂供试品取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），浸泡，振摇，作为供试液。

（3）肠溶胶囊（片）供试品称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内。

于45℃水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。

3　含抑菌成分供试品供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。

（1）稀释法将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。

（2）离心沉淀集菌法取规定量的供试液，离心（每分钟3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。

如有不溶性药渣，可先离心（每分钟500转）5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。

（3）薄膜过滤法取规定量的供试液，置稀释剂100ml，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45μm±0.02μm微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50-100ml，取出滤膜备检。

（4）中和法凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。

对照用菌液

控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。

对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）44102]、沙门氏菌[CMCC（B）50094]、铜绿假单胞[CMCC（B）10104]及金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]。

　　取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18-20小时后，稀释至1∶106。

对照菌的加入量为50-100个。

检查法

1　细菌、霉菌与酵母菌计数

（1）平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1∶102、1∶103等适宜的稀释度。

分别

取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每个稀释级应作2-3个平皿。

营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。

在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌落数，后者同时点计细菌菌落数。

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。

合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。

液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。

菌数测定阴性对照试验取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养、检查，不得长菌。

细菌培养时间为48小时，分别在24及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌、酵母培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。

点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

菌数报告规则细菌宜选取平均菌落数在30-300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30-100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。

如有1个稀释级在30-300（30-100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值。

当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值>2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30-300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30-300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级的平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级的平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。

如当1∶10（或1∶100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1∶10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。

（2）培养基稀释法取供试液（原液或1∶100供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml）。

每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。

每1ml注入的5个平板的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据。

以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。

如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告数为小于10个。

2　控制菌检查除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种，经增菌分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验与血清凝集试验等项检查。

（1）大肠杆菌（Escherichiacoli）取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50-100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。

培养18-24小时（必要可延至48小时）。

阴性对照应无菌生长，取上述3份培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察、阳性对照呈现荧光，MUG阳性，供试液MUG管呈现荧光，MUG阳性、无荧光，MUG阴性。

然后加入数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。

供试液MUG阳性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。

如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18～24小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。

或有菌落生长，应挑选2～3可疑菌落作靛基质试验（Ⅰ）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（V－P）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色、镜检，按表1规定判定判断结果。

靛基质试验（I）取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时，沿壁管加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

甲基红试验（M）取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于管内加入甲基红指示剂数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

乙酰甲基甲醇生成试验（V-P试验）取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时±2小时，于每2ml培养液中加入а-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时内出现红色为阳性，无红色反应为阴性。

枸橼酸盐利用试验（C）取可疑