分子生物学综合实验报告.docx

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分子生物学综合实验报告

分子生物学综合试验报告

综合实验Ⅰ.Southern杂交

（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、

地高辛标记的Southern杂交）

一.实验目的

1.学习Southern杂交的原理及操作方法。

2.学习碱裂解法提取质粒的原理。

3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。

4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二.实验原理

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：

DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、TaqDNA聚合酶、反应缓冲体系。

PCR循环由三个步骤组成：

变性、退火、延伸。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。

DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。

最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。

对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。

一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。

通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

地高辛随机引物法标记的原理：

在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。

以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。

一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。

免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。

三．实验准备

1.实验材料：

含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基，LB平板培养基

2.实验试剂：

TaqDNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶（EB），点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体，2×ligation缓冲液，T4DNA连接酶，LCaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL），TBE电泳缓冲液（5×），DIGRandomLabelingMix（高效），Anti-DIG-APConjugate，BCIP/NBTStockSolution，BlockingReagent。

20×SSC：

柠檬酸钠，3MNaCl，2×SSC：

柠檬酸钠，NaCl，EDTA，变性液：

NaOH，NaCl，中和度：

Tris-HCl、、3MNaCl，Standardbuffer：

5×SSC、%（w/v）N-Lauroylsarcosine,%（w/v）SDS,1%BlockingReagent，Standardbuffer+50%formamide，Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：

0.1MTris-HCl，MNaCl.pH=，封闭液：

1%BlockingReagent/Tris-HCl，NaCl，显色缓冲液：

Tris-HCl，NaCl，pH=，TE缓冲液：

10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH，2%，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的%），溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，TE缓冲液，无水乙醇和70%乙醇。

3.实验仪器：

微量移液器，离心管，DNA吸附柱，DNA收集管，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，恒温水浴箱，PCR仪，培养皿，超净工作台，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

四．试验方法

1.质粒的提取：

①培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。

②提取步骤

●取mL过夜培养的菌液，加入离心管中，6000rpm离心1min，尽量吸除上清，重复两次

●向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

●向离心管中加入250μL溶液P2，温和翻转多次使菌体充分裂解。

●向离心管中加入350μL溶液P3，温和翻转多次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm离心10min。

●将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm离心1Min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

●向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

●重复操作步骤6。

●将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min。

●将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min将质粒溶液收集到离心管中。

③琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA

2.聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA：

●按下表加入试剂，并小心混匀。

模板为实验一中提取的质粒DNA

试剂

体积（30µl）

ddH2O

12µl

PrimerP1（µM）

1µl

PrimerP2（µM）

1µl

模板

1µl

2xTaqMix

15µl

●设置PCR程序

●运行PCR程序

●反应结束后，取20μlPCR产物进行%琼脂糖电泳分析

3.地高辛标记的Southern杂交：

●将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。

●加入20mlStandardbuffer，65℃预杂交4-20小时。

●将制备的DNA探针沸水浴加热10min，迅速置冰浴5min。

全部加入杂交管。

●使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。

●杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20以备下次使用。

这样至少可以保存一年。

再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃10分钟以变性探针。

●取出杂交膜，用WashSolutionI洗5分钟×3次。

●保温冲洗：

用WashSolutionII于68℃冲洗15分钟×2次。

NBT显色检测法：

●经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。

●用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。

●用封闭液1：

2500—5000稀释Anti-DIG-AP，例如2μlAnti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。

稀释液4℃可稳定12小时左右。

●加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。

●用冲洗液洗15分钟×3次，每次100ml。

●按1：

50配制底物显色液：

例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。

●显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。

●加100ml底物显色液（100cm2）。

将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。

显色过程中可以观察。

一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。

应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。

●当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。

结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。

还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。

但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

五.实验结果及分析

图1中，共有16个条带，说明大家都提取成功了，只是右边几个亮度比其他的低，说明提取的DNA含量低一些。

图中有一些亮点，应该是胶上有杂质。

图质粒提取结果电泳检测

GFP质粒提取为8个人一组，所以上图共有四个条带，说明提取成功，而且亮度高，说明含量高。

上面图3中的第一张是班里的14个人的，后两张是另外14个人的，只是曝光时间不同。

三张图中的所有条带整齐而且亮度高，表明大家的P38质粒的PCR扩增很成功。

图质粒酶切结果检测

在酶切点样中，右边第一个为Marker,第二个为质粒，第三个为酶切，后面几个为质粒的PCR。

图中条带较整齐，有些亮度不够，可能是含量较低。

酶切条带与Marker的条带基本一致，但亮度稍低，含量较低，但总体来说酶切还是不错的。

图杂交显色结果

显色后，可以看到有两个PCR位点和酶切位点，一个质粒，说明杂交结果很好。

综合实验二.RT-PCR

扩增目的基因cDNA

（植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析；植物RNA提取、定量及电泳分析；RT-PCR扩增目的基因cDNA）

一．实验目的

1.掌握植物基因组DNA提取方法及注意事项，大分子量DNA分子的酶切分析。

2.掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。

3.学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

二．实验原理

CTAB可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。

通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液。

取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。

提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。

逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA（complementalDNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。

这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

三．实验准备

1.实验材料：

普通小麦幼苗

2.实验试剂：

TtizolReagent，氯仿，点样缓冲液Loadingbuffer（10×），DEPC处理的ddH2O，溴乙啶（EB），异丙醇，RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，MMLV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），引物（P1、P2），Taq酶及10×PCR缓冲溶液，DNA抽提液，.氯仿：

异戊醇（24：

1），70%乙醇，EcoRⅠ酶，HindIII酶，TaqDNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2）

3.实验仪器：

微量移液器，研钵，灌装液氮，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，PCR仪，恒温水浴锅

四．实验步骤

的分离与纯化：

●称取小麦叶片400mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到离心管中。

●加入1mlTrizolReagent，室温放置5min。

●加入氯仿，剧烈振荡15sec，15～30℃×3min。

●冷冻离心12000rpm×15min。

●将上清液转移到另一个离心管中，加预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。

●冷冻离心12000rpm×10min，弃上清。

●加入70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀，10000rpm×2min，挥发除去乙醇。

●加入30μlDEPC处理过的ddH2O溶解RNA。

●电泳检测

：

①RNA的反转录

●在PCR管中依次加入

RNA模板5μl

引物1μL

DEPC·H2O6μL

混合后，70℃水浴5min（破坏二级结构），迅速冰浴5min。

●在管中依次加入（反应体系为20μL）：

5×RTbuffer4μL

RNasin1μL

10mMdNTP2μL

M-MΜLV反转录酶1μL

置于42℃水浴，1h。

●70℃保温5min（使酶失活）。

②PCR扩增DNA

●在灭菌的PCR管中，依次加入

cDNA2μl

引物FW11μl

引物AW21μl

2xTaqMix10μl

●加ddH2O补足20μl，混匀。

设置PCR程序：

③PCR产物的鉴定

取10μlPCR产物进行琼脂糖电泳分析。

3.基因组DNA提取及鉴定：

①基因组DNA的提取

●取左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，加8ulRNase室温静置2min。

放入65℃水浴中，裂解30分钟，期间温和混匀几次。

●取出裂解好的DNA，加入700μl氯仿：

异戊醇（24：

1），猛烈混匀，离心（12000rpm，10分钟）。

●取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。

●将析出的DNA离心，12000rpm，10分钟。

●去掉上清，将沉淀用1ml70%乙醇清洗两次，挥发除去乙醇，溶于50μlTE或水中。

②gDNAPCR

反应体系：

2×mix15μL

FW1μL

AW1μL

gDNA2μL

ddH2O11μL

共计30μL

③gDNA酶切

反应体系：

gDNA30µl

EcoRⅠ1µl

10×EcoRⅠBuffer5µl

ddH2O19µl

共计55µl

④琼脂糖凝胶电泳检测并分析

●琼脂糖凝胶的制备:

称取琼脂糖加入40ml×TBE缓冲液中，于微波炉中加热熔解。

冷却至65℃时加入2µlEB，混匀。

●胶板制备:

将凝胶槽洗净擦干，在一端插好梳子。

然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入×TBE缓冲液），拔掉梳子。

●加样:

每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中。

●电泳观察:

接通电源，电压为80V，电泳1小时左右，当溴酚蓝到达下沿1--2㎝处时，停止电泳。

●观察及照相:

将胶板拿出，用自来水冲洗。

在紫外灯下观察结果。

图6.小麦RNA提取电泳检测

五．实验结果及分析

理论上，未降解的总的RNA电泳时，在凝胶中会出现18S和28S对应的条带。

但是在上图中，许多组都有5条带，而且有拖尾，说明有基因组DNA的污染。

有些组没有出现条带或亮度不够，说明RNA被降解了，可能是在操作过程中，受到环境中的RNA酶的污染，所以在实验操作中应戴手套，严格对实验材料和电泳系统中的RNA酶进行处理。

如果用普通琼脂糖凝胶电泳，要尽量减少电泳时间。

图7上为RT-PCR,下为基因组PCR，而且基因组PCR的条带亮度要高一些，说明基因组片段要比反转录得到的片段更大一些。

原因是由mRNA反转录得到的片段不含有内含子，而基因组中含有大量的内含子。

图8中结果显示，基因组条带离点样处很近，而且亮度很高，说明基因组所含DNA含量很高，片段很大。

所有组的条带并不是很整齐，可能在操作中没有处理净蛋白质或在吸取上清液是不小心把蛋白质给吸入了，造成污染。

还有组没有出现条带，可能是操作中不小心把基因组片段给倒掉了。

图9.小麦基因组酶切结果

图9中所示，小麦基因组酶切后，条带铺满整个泳道，而且亮度很高，说明基因组片段中含有很多的酶切位点，酶切后会有很多大小不一的小片段。

个别组的条带没有铺满整个泳道，说明酶切失败，可能是酶切时离心管中进水或酶受到了污染。

综合实验三.T-A克隆

（细菌培养、感受态细胞的制备及转化、T-A克隆的筛选和快速鉴定）

一．实验目的

1.学习细菌的培养方法及培养基的配置

2.掌握感受态细胞制备和转化的基本方法

3.掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA

4.掌握菌落PCR快速鉴定克隆

二．实验原理

在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌所用的培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。

实验室中最常用的是LB培养基。

在培养过程中会有延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。

受体细胞经过一些特殊方法如电击法,化学试剂法（CaCl2,RbCl，KCl）等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。

利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂---SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。

利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。

然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。

在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。

三．实验准备

1.实验材料：

大肠杆菌（含质粒）

2.实验试剂：

琼脂粉，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，NaOH，氨苄青霉素（100mg/mL），破碎细胞缓冲液（50mmol/LTris-HCl、1%SDS、2mmol/LEDTA、400mmol/L蔗糖、%溴酚蓝），10mg/ml溴乙啶，TBE电泳缓冲液（5×），TaqDNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2），dNTP，点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

%溴酚蓝，40%甘油

3.实验仪器：

微量移液器，DNA吸附柱，DNA收集管，1,5ml离心管，培养皿，立式离心机，培养皿，带帽试管，涂布器，灭菌锅，无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等），恒温摇床，电泳仪，离心管，Tip，PCR扩增仪，台式离心机，恒温水浴

四．实验步骤

1.LB培养基的配制：

配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：

细菌培养用胰蛋白胨10g

细菌培养用酵母提取物5g

NaCl10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/LNaOH调节pH位至。

加入去离子水至总体积为lL，在15lbf／in2×105Pa）高压下蒸气灭菌20分钟。

这样得到是LB液体培养基。

LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。

2.细菌的培养：

①在液体培养基中培养

过夜培养

●取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。

●用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。

●盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。

大体积培养

●按1∶100（V/V）的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。

●于37℃，约200r/min剧烈摇动培养。

②在固体培养基中培养

细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。

平板划线法分离单菌落

●采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。

●重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板

●于37℃培养直至长出单菌落。

3.感受态细胞的制备CaCl2方法）：

●从LB固体平板挑单克隆于5mlLB液体培养基中（不加抗生素），37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。

●将活化菌体按1～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为。

●取培养好的菌液ml于一离心管中，4℃离心8000rpm×1min。

●弃上清，加500μlCaCl2（灭菌预冷）洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1min。

●彻底除去残液,加200μlCaCl2（灭菌预冷），悬浮菌体。

●4℃冷冻离心8000rpm×1min。

●弃上清，加100μlCaCl2（灭菌预冷），悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。

4.大肠杆菌的转化：

●将连接产物加入100μl制备好的感受态细胞，冰上放置20min。

●42℃热激90s。

●迅速冰浴3min。

●加入800μlLB液体培养基，37℃轻摇90rpm培养45min。

●30μlX-gal和6μlIPTG混匀涂布在含有50μg/ml氨苄的LB固体培养平板中。

●取菌液100μl涂板。

●37℃倒置，避光培养16-20h。

●蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。

5.克隆的筛选和快速鉴定（菌落PCR快速鉴定法）：

●直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入25μl或50μlPCR反应体系中。

●用通用引物或特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。

试剂

体积（20μl）

ddH2O

8μl

PrimerP1（10μM）

1μl

PrimerP2（10μM）

1μl

模板

1个菌落或菌落稀释液

2*Taq酶Mix

10μl

五．实验结果及分析

图10.菌落PCR鉴定结果

图10中的结果可以分为三种：

第一种是只有一条亮带，与Marker中原来的DNA位置相同，这是想要得到的结果；第二种是没有条带，可能是挑取了蓝斑菌落或假阳性菌落，或者没有点上样；第三种是出现两条带或拖尾现象，可能是非特异扩增的结果。

综合实验四.GFP质粒的提取

（GFP质粒的提取、转化、表达）

一．实验目的

1、学习碱裂解法提取质粒的原理

2、掌握感受态细胞制备和转化的基本方法

二．实验原理

即实验一中的碱裂解法原理和实验三中感受态细胞制备及转化原理。

三．实验准备

即实验一和实验三中和GFP有关的试剂及实验用品。

四．实验步骤

即实验一中提取质粒的步骤和实验三中转化的步骤，最后观察GFP在菌落中的表达情况。

五．实验结果及分析

图质粒提取结果电泳检测

GFP质粒提取为8个人一组，所以上图共有四个条带，说明提取成功，而且亮度高，说明含量高。

如图13，在紫外灯的照射下，转化有GFP质粒的菌落发出绿色荧光，表明转化成功。

总结

本次大实验通过四个综合大实验来说明分子生物学实验的基本原理和操作方法。

经过八天的连续实验，我不仅仅学到了分子生物学实验的相关知识，更重要的是，我在老师的带领下，明白了科学实验的具体方法，第一次系统地去做试验，学习实验方案的设计，领悟实验的思路，为以后的科研道路奠定了一定的基础。

所以，总而言之，此次试验就是在过程中学习，在结果中学习的不断学习的实验。

此次实验中可能产生误差的原因有很多，其中没有对实验过程进行详细的记录、没有对实验过程进行很好的了解、操作中存在的基本技术失误