内农大分子生物学实验报告.docx

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内农大分子生物学实验报告

实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析

一、实验目的

通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。

二、实验原理

提取原理:

CTAB能溶解细胞膜,在高离子强度下,与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。

利用液氮对植物组织进行冷冻,研磨、破碎细胞后加入CTAB,将DNA溶解出,用酚、氯仿去除蛋白,经乙醇沉淀得到DNA。

定性原理:

琼脂糖凝胶电泳是把DNA样品加入到含电解质的琼脂糖凝胶的样品孔中,置静电场上。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。

若是DNA分子,在点样孔对应的正极端可观察到透明条带。

定量原理:

DNA或RNA在260nm波长处有紫外吸收峰,吸收强度与核酸浓度成正比。

紫外分光光度法还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值估计核酸的纯度。

三、实验步骤

.提取步骤

1.将100mg液氮冷冻条件下的拟南芥嫩叶在1.5mlEP管内研磨成粉末状。

2.加0.6ml2×CTAB液,混匀,65℃水浴30min,每10min颠倒混匀一次。

3.取出离心管,冷却后加入0.6ml酚氯仿混合液,混匀。

4.11,500rpm室温离心8min。

取400μl上清液到一新的1.5ml离心管中。

5.加入与上清等体积的氯仿,混匀,11,500rpm离心8min,取350ul上清。

6.加入600μl无水乙醇,上下颠倒混匀,-80℃放置30min。

7.4℃,15,800rpm离心20min,弃上清。

8.1ml70%乙醇(预冷)洗涤沉淀2次,上下颠倒几次,不能Vertex,7,000rpm离心3min,弃上清,风干(超清台操作)。

9.加入30μl无菌水(含20μg/mlRNaseA),37℃下溶解DNA30min。

10.在一PCR管加5μlDNA样品和1μl6×loadingbuffer,混匀,电泳备用。

.定性步骤——琼脂糖凝胶电泳

1.制胶

①0.3g琼脂糖和40mlTBE缓冲液混合,微波加热至熔化,制0.75%琼脂糖凝胶液。

②将内槽放置于水平位置,并在固定位置放好样品梳子。

③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时,加入核酸染料1.5μl,摇匀,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至板上形成一层均匀的胶面。

④室温静置到凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,将凝胶及内槽放入电泳槽中。

2.加样

用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,将DNAmarker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。

每加完一个样品,应更换一个加样头。

3.电泳

①接通电泳槽与电泳仪的电源,DNA片段从负极向正极移动。

最高电压不超过5V/cm。

②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。

③紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的条带,采用凝胶成像系统拍照保存。

.定量步骤——紫外分光光度法

(1)取1μl样品和19μlddH2O于1.5ml的离心管中混匀,备用。

(2)开机,调零。

先用0.1×TE缓冲液注入样品杯,放入样品槽,关闭盖板。

点击‘setref’键,仪器自动校正零点。

(4)吸已稀释的DNA样品转入样品杯,放入样品槽,关闭盖板。

点击“enter”键。

窗口同时显示260nm和280nm处的OD值。

(5)取出石英样品杯,用超纯水清洁石英样品杯,风干,加下一待测样。

四、结果与分析

.定性结果

CTAB法提取的DNA样品,经过琼脂糖凝胶电泳进行定性分析,结果如下图:

后四个泳道是本小组(第七组)的跑胶结果,对应样品标号是Y,X,S,J。

由电泳图可以看出:

所有样品经电泳后都提出了DNA,胶孔中没有蛋白质残留,有RNA污染。

条带较暗,DNA样品浓度较低,可能的原因是离心后取上清时取的体积过少;移液枪吸干残余的液体时可能带走少量的样品。

.定量结果

紫外分光光度计法,测得的样品光密度(OD值)如下表:

样品标号

A260

A280

A260/A280

Y

0.053

0.029

1.83

X

0.044

0.022

2.00

S

0.137

0.097

1.41

J

0.153

0.124

1.23

结果分析:

若DNA的A260/A280比值高于2.0,可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。

由表知,样品Y的A260/A280为1.83,其中的DNA纯度较好;样品X的A260/A280为2.00,被RNA污染;其余两个样品的A260/A280均低于1.83,纯度差,可能被蛋白质污染。

因为1OD260相当于dsDNA50μg/ml,ssDNA33μg/ml。

本实验提取出的是dsDNA分子,由此计算出样品Y的浓度是2.65μg/ml。

实验二PCR扩增目的片段

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

二、实验原理

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外核酸扩增系统,其原理类似DNA分子的天然复制过程,是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。

三、实验步骤

1.在200μlPCR管内配制20μl反应体系:

反应物体积/μl

ddH2O11.3

10×PCR缓冲液2.0

Mix

dNTP1.6

引物12.0

引物22.0

模板DNA1.0

rTag酶0.1

2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。

加样后用手轻弹混匀,6,000rpm离心15sec使反

应成分集于管底。

3.PCR反应热循环程序设置:

①94℃预变性3min;

②94℃变性30sec;

③64℃退火30sec;30cycles

④72℃延伸1min;

⑤72℃延伸10min;

⑥16℃pause

反应结束后短暂离心,置4℃保存备用。

4.配制0.8%的琼脂糖凝胶。

5.取5μlPCR产物,加1μl的6×loadingbuffer,轻弹混匀后进行电泳检测。

6.如果PCR产物非常特异,可以直接用于与载体的重组连接。

四、结果与分析

PCR产物经电泳检测,显示结果如下图:

除Maker外,其余四个泳道是本小组点的样。

依次是X,J,S,Y。

本图以实验一提取的DNA为模板进行的PCR扩增,只出现一条条带,条带较亮,说明扩增得到目的片段。

下面还有一条模糊条带,说明出现了二聚体。

实验三目的片段和载体的连接

一、实验目的

通过本实验掌握DNA重组连接方法。

二、实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这种重新组合的DNA叫做重组子。

DNA重组本质是一个酶促反应过程。

即在一定的条件下,DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5′端磷酸和3′端羟基之间相互作用,形成磷酸二酯键的过程。

一般的连接反应都是在T4连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中,将目的片段与载体进行连接。

三、实验步骤

1.在灭菌的Eppendorf管中,加入:

pMD-19T载体0.5μl

PCR产物4.5μl

Solution

5μl

2.盖好盖子,用手指轻弹EP管数次,并于台式离心机离心2sec以集中溶液。

3.将反应管放入16℃连接过夜(12~16h)。

实验四大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测

一、实验目的

通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

二、实验原理

受体细胞经过一些特殊方法(如:

CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。

CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法,其原理是使细菌处于0°C、CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球形,细胞膜的通透性发生改变,使细胞易于吸收外源DNA。

本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞,用CaCl2处理受体菌使其处于感受态,之后通过转化实验检测感受态细胞的转化效率。

三、实验步骤

1.挑取一DH5α单菌落于2mlLB培养基中,37℃过夜培养。

2.取其中1ml菌液于一含100mlLB培养基的锥形瓶中,37℃振荡培养2-3h至OD600值≤0.3-0.5。

3.将菌液转移到50ml冰浴好的离心管中,冰上放置10min。

4℃,3,500rpm,离心10min。

4.倒出培养液,每管菌体悬浮于5ml(1/10)MIXⅠ(务必放冰上)。

4℃,3,500rpm,离心10min,回收细胞。

5.每管菌体悬浮于1ml(1/50)MIXⅡ,(务必放冰上)。

6.分装,将感受态细胞分装成100μL一份,置于4℃保存。

四、实验结果

步骤2中,本小组测得OD600值是0.380,满足要求。

实验五重组质粒的转化

一、实验目的

通过本实验,掌握重组质粒的转化方法和原理。

二、实验原理

经CaCl2法制备的感受态细胞膜的通透性发生改变,外源DNA附着于细胞膜表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。

本实验采用大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞,与以上实验所得重组连接的质粒载体共保温实现转化。

蓝白斑筛选:

载体中有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸(α肽链)的片断基因。

宿主具有编码β-半乳糖苷酶的C端基因。

当二者产物组合在一起,就具有活性酶的产生,此现象称为α互补。

在诱导物IPTG作用下,由α互补形成β-半乳糖苷酶,可分解培养物中的X-gal使其呈蓝色反应。

如果外源基因插入位于LacZ基因内部的多克隆酶切位点中,导致不能编码β-半乳糖苷酶,菌落呈正常的白色。

没有插入外源片断的则是蓝色的。

三、实验步骤

1.取实验三重组质粒10μl加入100μl感受态细胞,混匀轻弹,静置冰浴30min。

2.将管放到42℃水浴锅中,热激90sec。

冰浴2min。

加500μlLB液体培养基。

3.37℃温育45min,130rpm慢摇

4.在预制的LB琼脂平板上,加40μl20mg/mlX-gal和16μl50mg/mlIPTG溶液。

5.用灭菌玻璃棒均匀涂布。

37℃温箱中放置30min。

6.3,500rpm,离心2min。

弃约500μl上清,将剩余菌液轻轻吹打混匀涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,晾至液体被吸收。

7.倒置平皿37℃培养12-16h,出现单菌落。

四、结果与分析

经培养,转化成功,板上均长出单菌落。

可观察到阴性对照板内不长斑,阳性对照板内长有较多白斑,加了重组质粒的板内长出了分散的白斑和零星的蓝斑,其中白色菌落为含有重组DNA质粒的菌落。

实验六菌落的PCR鉴定

一、实验目的

通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。

二、实验原理

重组子经过蓝白斑筛选后(具有假阳性),接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。

用灭菌后的牙签轻轻粘取白色菌落的部分菌体,在准备好的双蒸水中洗涮一下,充分混匀,取一定量加入PCR反应体系,在PCR反应循环中,95℃加热可以使细菌破裂,释放出重组质粒作为PCR扩增模板。

采用外源基因特异性引物进行扩增,如果重组质粒转化入宿主细胞,则可以扩增得到预期大小的目的片段。

三、实验步骤

1.用200μl的枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15μl无菌水中,从中取2μl菌液作为菌落PCR模板。

在200μlPCR管内配制20μl反应体系:

反应物体积/μl

ddH2O10.3

10×PCR缓冲液2.0

dNTP1.6

引物12.0

引物22.0

菌液2.0

rTag酶0.1

2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。

加样后用手轻弹混匀,6,000rpm离心15sec使反

应成分集于管底。

3.PCR反应热循环程序设置:

 

①94℃预变性3min;

②94℃变性30sec;

③64℃退火30sec;30cycles

④72℃延伸1min;

⑤72℃延伸3min;

⑥16℃pause

反应结束后短暂离心,置4℃保存备用。

4.配制0.8%的琼脂糖凝胶。

5.取5μlPCR产物,加1μl的6×loadingbuffer,轻弹混匀后进行电泳检测。

四、结果与分析

结果如下图:

除两边Maker,其余6个泳道是本小组点的样;对应样品7-1,7-2,7-3,7-4,7-阴,7-阳。

由图看出,样品7-1和7-3转化成功,样品7-2和7-4挑取的是假阳性菌落。

实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定

一、实验原理

碱裂解法的基本原理:

细胞膜在碱性环境中迅速溶解。

通过离心,染色体DNA由于无法迅速复性,与蛋白质-SDS复合物等一起被沉淀下来;而质粒由于分子量小,空间结构使其即使变性也仍然盘绕在一起,容易复性而溶解在上清液中。

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤:

①培养细菌,使质粒DNA大量扩增;②收集和裂解细菌;③分离和纯化质粒DNA。

酶切鉴定原理:

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

由于限制性内切酶的切割特性不同,分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶(切割位置在识别序列内部)。

对质粒进行酶切,通过跑胶观察片段大小,从而鉴定质粒。

二、实验步骤

1.吸附柱中加500ul平衡液(BL),12000rpm离心30s,弃收集管中的液体。

2.取1.5ml菌液至2ml离心管中,12,000rpm离心1min。

弃上清。

3.加250ulsolutionⅠ(P1),vortex。

4.加250solutionⅡ(P2),上下颠倒混匀。

操作时间不能超过5min。

5.加350solutionⅢ(P3),立即颠倒混匀几次。

12000rpm离心10min。

6.吸取上清加入吸附柱中,尽量不要吸入沉淀12000rpm离心30s,弃收集管中的液体。

7.加入600μL漂洗液(WB)于离心吸附柱中,静置1min后12000rpm离心30-60s,倒掉废液。

重复一遍。

8.空管离2min。

将吸附柱放入1.5ml离心管中,在超净台中晾5min。

9.滴加50ulelutionbuffer(EB)至膜中央,室温放置2min后,12000rpm离心1min。

离心管中即为纯化后的质粒。

10.在冰浴上建立酶切反应体系(20μl)

ddH2O12μl

重组质粒5μl(本实验提取的重组质粒DNA)

10×NEBBuffer22μl

EcoRⅠ0.5μl

HindIII0.5μl

Total20μl

限制性内切酶最后加入,手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸混匀,3,000rpm离心15sec。

37℃水浴温育90min。

11.取2μl酶切产物,加入4μl6×上样缓冲液,混匀。

12.取5μl纯化后的质粒,加1μl的6×loadingbuffer混匀,与上一步骤的样品一起跑胶,作为对照,也可鉴定目的片段与载体的连接结果。

三、结果与分析

本小组的实验结果如下图:

最后4个泳道,是本组点的样。

对应样品:

7-质粒,7-1,7-3,7-阳。

由图可知,质粒分离成功,该加样泳道只显示出一个条亮带;两个样品及阳性对照均酶切得到目的片段,因为可以看到每泳道可以观察到两个条亮带,是酶切后的目的片段和载体片段,(500bp和2000bp)。

但是,样7-1的酶切出现3条带——最上面的条带,可能是由于酶切不完全造成的,原因可能是酶切时间不够,也可能是由于酶的浓度过低或者质粒浓度过高,部分质粒未被切开,出现上面未切开的质粒条带。

 

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