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完整分子生物学实验报告
甘薯adk基因的核心片段的克隆
西南大学生命科学学院
王丽222014317011011
摘要：
甘薯为我国农业主要栽培作物，并且是分子生物学实验室常见材料，本次实验主要以甘薯叶片（部分为茎）为实验材料，第一次实验是用CTAB法提取甘薯DNA，PCR扩增再凝胶电泳检测纯度。
第二次实验从材料中提取检测RNA并反转录cDNA第一链，经PCR扩增得到ADK基因核心片段，将其与T载体相连并导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，扩增后在加有相应抗生素的LB平板上筛选阳性克隆，这对后续生物信息学分析等有重要意义。
关键词:
甘薯;PCR技术;cDNA；adk基因;感受态大肠杆菌细胞
Abstract：
Sweetpotatoformyagriculturalmaincultivationcrop,andismolecularbiologylaboratorycommonmaterial,thistimesexperimentmaintosweetpotatoleaves（partforstems）forexperimentmaterial。
FirsttimesexperimentwasextractedbyCTABmethodDNA,PCRamplificationandgelelectrophoresisandpurityofsweetpotato。
ThesecondexperimentfrommaterialintheextractionRNAandreverserecordedcDNAfirstchain，byPCRspreadincreasedgetlargeADKgenecorefragments,electrophoresisdetectionrubberrecyclingADKgenecorefragments，willitsandTcarrierconnectedandimportEscherichiacoliDH5（feelstatecell）in,spreadincreasedinplushascorrespondingantibioticsofLBTabletShangfilterpositiveclonethisimportancetosubsequentbioinformaticsanalysis。
keywords:
Sweetpotato;PCRtechnologies;cDNA;（AdenylateKinase）adkgene;Competentescherichiacolicells
综述：
1。
材料及研究意义
1。
1甘薯
甘薯（Ipomoeabatatas（L.）Lam.）又名地瓜、红薯、白薯、番薯、红苕等，薯蓣科薯蓣属，多为一年生或多年生草本。
其根有纤维根、柴根、块根，粗壮的不定根不断膨大形成块根;甘薯的皮有淡红、红、红紫、淡黄、黄褐等；薯肉颜色有白、黄、杏黄、紫、橘红等.甘薯属喜光的短日照作物，性喜温，不耐寒，较耐旱.主要分布在北纬40°以南，原产于热带美洲.栽培面积以亚洲最多,是我国主要的栽培作物，栽培面积和总产量居世界首位，它所富含的淀粉是重要的轻化工和食品加工原料。
同时研究发现，甘薯中富含营养价值，块根茎叶中均含蛋白质、糖类化合物,脂肪、维生素、黄酮类化合物和多酚类化合物等.甘薯也有一定的药用价值,在改善人群维生素缺乏症状、抗肿瘤、抗突变、抗氧化及降低血脂、胆固醇、血糖和增强人体免疫力作用等方面也有一定进展。
1.2ADK基因
从甘薯中克隆得到的腺苷酸激酶基因cDNA（IbADK），全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码284个氨基酸残基的蛋白。
而且IbADK与马铃薯ADK序列相似度达83％.IbADK在甘薯块根和幼叶中高表达，有利于促进两种代谢活跃组织中ATP、AMP、ADP的分子代谢，进而调控淀粉代谢和核酸代谢。
1。
3研究目的和意义
本次试验通过基因工程技术获取了甘薯adk基因片段,甘薯adk基因的获取,为进一步在分子遗传学水平探讨ADK在甘薯淀粉生物合成中的作用机理，用于遗传转化甘薯,实现甘薯淀粉代谢工程,最终用基因工程技术获得的含有ADK基因的基因工程菌菌株用于转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物,获得转基因修饰的高淀粉甘薯新材料或新品种奠定了基础。
2。
材料与方法
2.1材料、仪器及试剂
2。
1。
1实验材料：
甘薯叶片（幼嫩）
2.1。
2实验仪器
PCR扩增仪、PCR用薄壁管、无菌超净台、离心机、移液枪、Eppendorf管、10ml离心管、RNase—Free离心管、冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像系统、旋转振荡器、移液枪、计时器、研钵﹑杵,药勺，两面板（蓝板）、吸附柱CR3、低温冰箱、
2.1.3实验试剂
CTAB抽提液、LB液体培养基、RNAsimpleTotalRNAKit（总RNA提取试剂盒—-TIANGEN）、RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒（＃k1622）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、提取试剂裂解液RZ、蛋白液RD、漂洗液RW、MiniQH2O
、PCRbuffer、MgCl2、dNTPmix、引物F-ADK、引物R—ADK、Taq、CaCl2溶液
2.2方法
2。
2.1DNA的粗提（CTAB法）
1．向10ml离心管中预先加入4mlCTAB抽提液及相应量的β-巯基乙醇，65℃预热；
2．取约1g的新鲜幼嫩甘薯叶片用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入该10ml离心管中，迅速混匀；
3.于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）振荡三次混匀；
4。
冷至室温后加入等体积（4ml）氯仿：
异戊醇（24：
1），轻柔颠倒混匀使乳化10min；
5。
10000转／分离心10min（18—20℃）;
6。
吸取上清（约4至5ml）于另一干净的10ml离心管中；（重复４。
５步骤，也可省略此步）
7.吸取上清加入与上清液等体积（约4至5ml）且已于-20℃预冷的异丙醇,颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现；
8.用玻璃钩子挑出DNA（或用被剪去尖端的1.5mlTip头吸住DNA沉淀团）,放入盛有1ml75％乙醇的1.5mlEppendorf管中；
9.用75%乙醇漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇；
10。
用1ml75%乙醇再漂洗一次；
11。
用无水乙醇再漂洗一次；
12.沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；注：
不要过度干燥
13。
加500μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶,得DNA粗提物，可用于琼脂糖凝胶电泳、PCR等。
14。
取5微升DNA粗提物于0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测DNA质量。
2.2。
2植物RNA的提取及检测及反转录
一．甘薯RNA提取
用RNAsimpleTotalRNAKit（总RNA提取试剂盒—-TIANGEN）提取甘薯RNA。
1.取适量新鲜甘薯叶片或者甘薯块根在液氮中磨碎.取不多于0.1g（50-100mg）冷冻的研磨过的植物组织，加入1ml提取试剂裂解液RZ中,振荡至彻底混匀。
2.将混匀样品室温（15—30℃）放置5分钟。
注意：
平放离心管，使表面积最大。
3.加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒混匀，室温放置3分钟。
4。
4℃12,000rpm离心10分钟，取上层水相（约400ul）转入新的无RNase离心管.注意：
不要吸到沉淀。
5。
缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀,并将此混合液一起转入吸附柱CR3中，4℃12，000rpm离心1min，弃掉废液。
6.向吸附柱CR3中加入500ul去蛋白液RD,4℃12,000rpm离心1min,弃废液.
7.向吸附柱CR3中加入700ul漂洗液RW，室温静置2分钟，4℃12，000rpm离心1min,弃废液.
8。
向吸附柱CR3中加入500ul漂洗液RW，室温静置2分钟,4℃12，000rpm离心1min,去除残余废液。
9.吸附柱CR3转入1个新的离心管，加45ulRNase–free灭菌双蒸馏水,室温静置2分钟，4℃12,000rpm离心2分钟。
即得RNA。
10。
取5ul进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二．反转录cDNA第一链的合成
用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒（＃k1622）进行第一链cDAN的合成。
1）、反应体系：
1:
DEPC—treatedwater6.5ul
2:
oligo（dT）18primer2ul
3:
TemplateRNA4ul
4：
10mMDNTPMix2ul
5：
RNaseinhibitor0.5ul
6：
5×Ractionbuffer4ul
7:
MVReverseTranscriptase1ul
totalvolume:
20ul
2）、反应条件：
1：
42℃-60min；
2:
70℃-5min
反应结束后，产物贮存在-20℃的冰箱中（1个星期）.
2.2。
3PCR扩增adk基因及检测
用PCR法扩增adk基因,然后用1%凝胶电泳检测PCR产物的质量并拍照记录实验结果。
每个小组做两个50μl反应体系，一组模板为cDNA，另一组为质粒。
1．在50ul的PCR反应管中依次加入如下组分：
PCR反应体系：
1）MiniQH2O36μl
2）10×PCRbuffer5μl
3）25mMMgCl23μl
4）10mMdNTPmix1μl
5）引物1（10μM）F—ADK1μl
6）引物2（10μM）R—ADK1μl
7）模板（DNA）2μl
8：
Taq（2to5units/ul）1μl
总体积50.0μl
2。
短暂离心混匀各组分后，将PCR反应管放入PCR仪。
PCR反应的程序如下：
Ⅰ）94℃5min
Ⅱ）94℃45s；56℃45s;72℃1min（33个循环）
Ⅲ）72℃8min
Ⅳ）4℃保存
3.取5ulPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果。
2.2.4adk基因片段的回收及连接
1.回收：
除去电泳的5ul,剩余的45ul用TIANGEN离心柱型试剂盒进行回收。
2.DNA回收片段与pMD—19TVector载体的连接。
在200µLEppendorf管中加入下列组分：
连接体系
pMD—19TVector0.5µl
InsertDNA4.5µl
SolutionI5µl
加dH2O至10µl
轻轻混匀，16℃连接30min以上（或者连接过夜）用于转化DH5α感受态。
2.2。
5大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）
1。
从新活化的E。
coliDH5α菌平板上挑取一单菌落,接种于3～5mLLB液体培养中，37℃振荡（220rpm左右）培养过夜（12h左右），至对数生长期。
将该菌悬液以1：
100～1:
50转接于100mLLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，至OD600nm为0.2-0.4时即可用于感受态的制备；
2。
取培养好的菌液1mL移入1.5mL无菌的离心管中（每组做4管），在冰上冷却20-30min；
3.4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始,所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）;
4。
倒净上清培养液，用1mL预冷的0。
1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞（沉淀），冰浴30min；
5.4℃，4000r／min离心10min；
6.弃去上清液，加入200µL冰冷的0。
1mo1／LCaCl2溶液,小心悬浮细胞，冰上放置2—7h后，即制成了感受态细胞悬液,用于转化；
7。
制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后液氮速冻,置于超低温冰箱（—70℃）条件下，可保存半年至一年。
2.2。
6连接产物的转化、筛选及PCR检测
1。
将10μlDNA的连接物加入一管感受态细胞中,混匀后放置冰上30分钟（同时做两个对照组即本组质粒和老师提供的质粒DNA对照组.）
2.42℃水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min，室温下放置3-5min。
3。
上述各管中分别加入800l37℃预热的LB液体培养基至总体积为1ml，混匀后37℃180rpm培养1—2h左右至菌复苏（并使转化体产生抗性）。
4.4000rpm离心10min，去800l上清液，将剩余的200l菌液混匀。
5。
用烧烤过的涂布棒将100l的菌液涂布于加相应抗生素的LB固体培养基涂匀，晾于超净台上1h左右至菌液完全被培养基吸收。
6.7℃倒置培养12-14h.
7.培养24小时后平板上长出均匀的单菌落,从平板上用无菌牙签或者枪头挑取抗性菌落培养，再进行PCR鉴定（PCR的方法条件可同目的基因的克隆）。
3.结果与分析
3。
1甘薯DNA提取
图3—1甘薯DNA提取电泳检测图
实验结果：
倒数第三条泳道是本小组提取的DNA实验结果图，有三处亮带.
结果分析:
三处亮带从上往下依次为:
蛋白质杂质（点样孔附近）、DNA、RNA（已降解为亮团），全班的DNA都有条带,证明DNA提取成功。
只是DNA条带的亮度不同，本小组的条带还比较明亮，说明DNA的提取量还比较多。
各个小组DNA条带亮度、宽度不完全相同,可能是由于移液枪不准，取得原料量不同,DNA溶解度不同等因素造成的。
RNA呈现亮团是因为RNA在空气中不稳定，容易被RNA酶降解，本实验是提取DNA，所以RNA降解对实验没有多大影响.抽提到的植物总DNA在凝胶电泳检测时应呈现涂抹片状（即smear状），这是因为植物总DNA在抽提过程中降解成长短不一的均匀分布的片断所致.为最大限度的避免DNA降解，提取过程中各种操作均应温和的进行，避免剧烈振荡,不可用反复吸打的方法助溶DNA沉淀。
3。
2RNA的粗提
提取甘薯叶片总RNA的电泳检测
图3—2甘薯RNA的电泳检测
实验结果：
甘薯RNA的电泳检测图上呈现三条RNA个条带.
结果分析：
本小组的RNA检测结果在倒数第三条泳道,还是可以清晰RNA三个条带,从下往上分别是5.8s、18s、28s。
说明我们甘薯RNA成功提取成功，但是我们组的电泳结果没有其他组理想，电泳条带没有其他组亮。
有可能是我们组取材较少，受RNA酶影响较多，电泳点样时讨论说话造成空气中的RNA酶增多，使RNA发生降解，RNA提取量较少。
之前跑电泳结果异常，重新配胶后得上面电泳结果图，说明前一次配胶错误，配胶及胶的质量对电泳至关重要.
由于RNA极易被RNA酶降解，加上RNA酶非常稳定而且广泛存在（如玻璃制品、塑料制品、电泳槽及手和唾液等），因此在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。
本实验中主要采取下列措施：
（1）所有玻璃器皿使用前均须在180度的烘箱中烘烤2h以上,塑料器皿可用0。
1％DEPC水浸泡或用氯仿洗涤；
（2）RNA电泳槽,须先用去污剂洗涤后,用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3％H2O2溶液中,室温下放置10min，然后用0.1%DEPC水彻底冲洗，晾干备用；（3）RNA实验所用的设备应专门准备一套，例如移液枪、枪头盒和电泳槽等可贴上RNA专用的标志；（4）实验过程中勤换一次性手套；（5）为避免RNA酶的污染，提取RNA的所有试剂和用具物品必须是专用的,必须小心操作，保证试剂药品如TRIzol,氯仿和异丙醇等不被污染;（6）提取前可先用无水乙醇或氯仿对通风橱中的操作桌面进行清理工作，再将待用的物品如移液枪、枪头盒及离心管架等放置好;（7）在RNA的提取过程忌讲话谈论，忌人员走来走去；（8）DEPC和甲醛等剧毒物品，应小心按有关的实验规定进行操作和处理。
3.3PCR扩增ADK基因
图3-3PCR扩增ADK基因电泳图
实验结果：
目的基因为750～1000bp，在这个范围内只有质粒扩增出了adk基因，cDNA没有扩增出目的基因。
结果分析：
本小组的结果如图标记，左边是cDNA,右边是质粒.质粒扩增出了adk基因，cDNA没有扩增。
可以看出还是有三个小组的cDNA也扩增出了adk基因。
本小组cDNA没有扩出来是因为提取的甘薯RNA量较少，其反转录的cDNA的量不多，所以无电泳结果。
PCR中Taq酶永远最后加入反应体系，酶极易失活，应该在冰盒上操作,用完及时放回冰箱中;
3.4大肠杆菌感受态细胞的制备结果
因为实验中没有做大肠杆菌感受态细胞的感受强度检测,其结果在最终结果中进行分析。
3.5连接产物的转化、筛选及PCR检测
3。
5.1连接转化后的大肠杆菌平板
图3-5-1连接转化后的大肠杆菌平板
实验结果：
加有氨苄霉素的平板上长出了大肠杆菌单菌落。
结果分析：
从图中可以看出连接转化后的大肠杆菌菌落长势很好，菌落在平板上分布较均匀且绝大多数为单菌落。
由于培养基加入的有氨苄抗生素，所以在平板上生长的菌此时都具有氨苄抗性。
说明质粒进入了大肠杆菌，从而达到了筛选的目的。
3.5。
2PCR菌检电泳结果
图3-5—2PCR菌检电泳图
实验结果：
PCR菌检电泳图中除了阳性对照，其它的条带无阳性，都呈阴性状态。
结果分析：
左边第一个泳道是阳性对照，最后一个泳道是Maker，全班的结果都呈现阴性，而阳性对照有结果，所以排除凝胶配制、电泳、及操作问题。
之前我们认为可能的原因是阳性菌过了生长期,其他杂菌生长，挑菌时挑到杂菌.通过老师后续更换水产所的Taq酶用之前检测无阳性的菌液进行PCR扩增、检测出了阳性结果，以及多次进行取酶量不同实验对比后得知没有阳性的原因是实验室的Taq酶活性较低，取1μl远不能使PCR扩增出结果.质粒之所以能扩增出来是因为质粒含有纯得adk基因，模板单一，引物结合多，即使Taq酶活性较低也易扩增出阳性结果。
实验中存在一个问题，即无法确定感受态细胞的制作情况，使后面原因分析有所欠缺。
以后实验中一定要加进去大肠杆菌感受态细胞的感受强度检测。
4。
实验小结与体会
整个分子实验完成后，我收获颇多。
最后克隆提取了甘薯adk基因的核心片段，整体效果较好，自己也比较满意。
实验中我认为第一重要的是实验准备.因为分子实验做的都是较微量的工作，所以器具的使用、试剂的配置和认真仔细的态度是至关重要的。
有可能取样稍有偏差就会导致错误的结果，所以第一堂课关于器具的使用等的实验准备是很必要的.在之后,制胶、点样、无菌操作等都需要细心认真,尤其是接种时，班内有好几个同学涂布器太热烫死菌种，使平板上没有成功长出单菌落.第二就是时间的控制，无论是制胶的时间,还是跑电泳的时间，平板培养的时间都是要严格把控的。
时间若出问题有可能之间出现奇怪的结果,如电泳异常、杂菌污染等.第三合作交流是必不可少的，多交流就会少些出错，一起合作才会加快实验效率。
比如小组内做PCR反应体系，我们一般会一人负责一种试剂的加样，这样又快又减少了误差.第四点是我从曾老师身上学到的，就是认真负责的科研态度。
我们班在最后的转化阳性因子的检测中结果全无阳性,然后大家都很失落地离开了实验室，去分析可能的原因为下次的汇报做准备。
结果老师自己借了水产所的Taq酶重新做了一遍,同时做了几组水产所和实验室酶不同含量的对照实验，最后找出我们失败的原因是实验室的Taq酶活性太低。
即使我们的汇报从连接过程、平板的制作、感受态细胞的制作情况、无菌操作、其他人为操作因素等进行原因思考猜想，但我听了老师的解释后觉得我们这是一种不负责任的态度。
做实验初衷不就是排除多种可能，找出正确的结果吗?
我们不应该看到失望的结果扭头就走,而是应该心平气和地坐下了讨论，继续通过实验验证或排除我们的猜想，一起找出原因。
做人做事都是如此，若是见了失败就往后退，那么之后你再走到那儿，仍是失败。
只有不怕失败，每一次勇敢面对、找出原因,下一次才会做得更好。
关于实验的建议有两点，第一,建议以后可以在课表上连排分子实验课，这样更利于大家的学习、操作和体会实验研究的感受。
第二，以后实验中一定要加进去大肠杆菌感受态细胞的感受性检测，以便于进行后续的结果分析。
5。
参考文献
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【2】杨海东，郭彦东，贺山峰.甘薯营养成分和药用价值分析[J].《河南农业》2011年第0卷第1X期49—49页,共2页
【3】刘超,王征，兰时乐,董蕾。
甘薯保健成分及其功能的研究进展［J］。
《农业科学与技术：
英文版》CAS2007年第8卷第1期7—13页,共7页
【4】刘主,朱必凤，彭凌,等。
甘薯糖蛋白降血糖与抗氧化作用研究[J]。
食品科学，2008，29（11）:
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