酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用.docx
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酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用
酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用
摘要目的：
研究免疫增强活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯（SPS）的修饰条件。
方法：
通过L
9（3）4正交设计对氯磺酸-吡啶法制备SPS的工艺进行优化，并以MTT法测定其对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的促进作用。
结果：
最佳修饰条件为氯磺酸∶吡啶=1∶6（V/V），反应温度70℃，反应时间3h，硫酸基取代度可达1.092。
在50～200μg·mL-1内，最佳工艺所得SPS对小鼠脾淋巴细胞生长有显著促进作用，平均增殖率可达89.85%。
结论：
优化方法制备的SPS对小鼠脾淋巴细胞生长具有显著的促进作用。
关键词葡聚糖；酵母；氯磺酸-吡啶法；淋巴细胞
我国的酵母资源十分丰富，年产啤酒沉淀酵母泥3～5万吨（干基），目前该资源仅作为饲料廉价销售或直接作为废物排入下水道，既造成环境污染又造成资源浪费[1]。
酵母细胞壁是生物活性较强的β-1,3-D-葡聚糖的重要来源之一，其中碱不溶性β-1,3-D-葡聚糖占85%[2]。
由于其分子量大，在水中溶解性差，使其在应用上受到很大限制。
利用现代生物技术对酵母废泥进行充分开发利用，使其中β-1,3-葡聚糖得以综合利用，将大力推动医药产业的发展。
多糖硫酸酯化修饰后由于所带硫酸基团的空间位
阻和静电排斥效应改变了原来的空间结构，增加了
糖链的屈伸度，提高了水溶性，从而引起生物活性
的改进与改变
[3]
。
现今多用氯磺酸
-吡啶（Wolfrom）法进行改良，
借以达到不同的修饰目的
[4-6]
。
本研究通过控制酯
化试剂比例、反应时间、反应温度，开展酯化工艺的
研究，以制备免疫活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯
（SPS）。
1仪器与药材
冷冻干燥机
（
北京博医康实验仪器有限公司
）；
二氧化碳培养箱
（Thermo）；
酶标仪
（Bio-Tek）；
倒置
显微镜（Olympus）；透析袋（南京都莱生物技术有限
公司
）；96
孔培养板
（Costar）。
酵母葡聚糖（纯度90%，本校微生物学教研室
提供）；无水吡啶、无水二甲基亚砜（DMSO）、刀豆蛋
白（ConA）为Sigma产品；RPMI1640培养基、新生小
牛血清为
Gibco产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）为
Amresco产品；其它试剂均为分析纯。
清洁
II级雄性ICR小鼠，体重（20±2）g；中国药
科大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（苏）
2008-0010。
2方法
2.1酵母葡聚糖的硫酸酯化
将吡啶加入附有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶
中
，
置于冰盐浴，逐滴加入氯磺酸，10min滴加完
毕。
再加入酵母葡聚糖20mg，立即将其移入预热的
油浴中于
40～100℃恒温反应。
反应完毕后，将反应
液倾入冰水中，以10mol·L
-1
NaOH调至pH中性，
以去离子水透析
48h，透析液浓缩醇沉、复溶、冻
干
，即得SPS，得率80.78%。
2.2SPS对小鼠淋巴细胞生长的影响
[7]
将小鼠脱颈处死
，
取脾脏
，
去外周结缔组织
，
并用
不含血清的
RPMI1640培养液清洗脾脏，以匀浆器研
磨脾脏成单个脾细胞
，200
目的尼龙筛网滤过
，
以红细
胞裂解液
1000r·min
-1
离心洗涤细胞两次
，
以培养基
洗涤一次
，
最后以含
10%小牛血清的RPMI1640培养
液悬浮细胞
，
置
37℃恒温、5%CO
2
孵箱中孵育
4～6h，
除去贴壁的巨噬细胞
，
悬浮的即为小鼠脾淋巴细胞。
以培养基调整小鼠脾淋巴细胞浓度至
5×10
6
/L，于
96孔板每孔加100μL细胞悬液，再加入含SPS培养
液（终浓度分别为50、100、200μg·mL
-1
），每孔终体积
为
200μL，同时设定空白对照和阳性对照（ConA，终浓
度
7.5μg·mL
-1
）。
每浓度设4个复孔，置37℃、5%CO
2
培养
44h后，每孔加入MTT（5mg·mL
-1
）20μL，
继续培
养
4h，3000r·min
-1
离心
20min，弃上清液，每孔加入
DMSO100μL，混匀，酶标仪570nm处检测吸光值。
2.3酵母葡聚糖硫酸酯化条件的优化
[8]
以免疫细胞的增殖率为响应值，采用3因素3水
平的正交实验
L
9
（3
4
）对试剂比例、反应温度和反应时间
进行正交试验优化。
正交实验方案及结果列于表1中。
2.4硫酸根含量的测定及取代度的换算
[9]
采用氯化钡
-明胶比浊法测定多糖样品中的硫
酸根含量。
分别吸取浓度为1.0mg·mL
-1
的硫酸钾标准
品溶液
0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，各以1mol·L
-1
的盐
酸溶液补至
4mL，摇匀，分别加入3.5mL0.8%的三氯
乙酸溶液，摇匀，再分别加入2.5mL氯化钡-明胶溶
液（1.0gBaCl
2
溶解于
200mL的0.5%的明胶水溶液
中），摇匀，室温下静置15～20min，以第一管为空白
对照
，
测定
360nm处吸光度。
精密称定SPS10.0mg，
置玻璃瓶中，加1mol·L
-1
盐酸溶液
10mL，振摇至供
试品全溶，于100℃水解6h。
冷却后，过滤除去不溶
物即得供试品溶液
。
取供试品溶液4mL两份，各加
3.5mL0.8%的三氯乙酸溶液，摇匀，一份加2.5mL的
氯化钡
-明胶溶液，另一份加2.5mL的明胶溶液，摇
匀，其余操作同标准曲线。
以取代度（Degreeof
substitution,Ds）表示每个葡萄糖残基上硫元素的个
数，取代度的计算公式为：
Ds＝[1.62×ω（s）]/[32-1.02×ω
（s）]，其中ω（s）为样品中硫的百分含量。
3结果
3.1SPS对小鼠脾淋巴细胞的促增殖作用
通过
MTT法考察梯度浓度SPS（样品终浓度分
别为
50、100、200μg·mL
-1
）对小鼠脾淋巴细胞的体
外促增殖作用，结果如图1。
图
1硫酸酯化酵母葡聚糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用
（注：
与空白组对照，细胞增殖的显著性差异，
#
P<0.05,
##
P<0.01）
对小鼠脾淋巴细胞的促增殖作用随样品浓度的
增加而增强。
正交设计实验所得1、2、4、5、7、8号样品
在终浓度为
200μg·mL
-1
时，促进增殖作用较空白组
有极显著差异
。
其中4、5号样品活性最佳，增殖促进率
分别达
86.94%、85.16%，与阳性药物ConA相近。
3.2硫酸酯化修饰的正交实验
正交试验数据及结果见表
1。
结果表明，以淋巴
细胞增殖率为指标，各因素对细胞增殖的影响程度依
次为反应温度
>反应时间>试剂比例，最佳组合为酯化
试剂比例
1：
6、反应温度70℃及反应时间3h。
对上述指标的结果进一步进行方差分析（见表
2），结果表明，酯化反应各因素对小鼠脾淋巴细胞
增殖率均有显著的影响
（P<0.05）。
用优化工艺进行
3批验证实验，淋巴细胞增殖率
分别为
96.94%、85.16%、87.46%，平均值为89.85%。
以
最佳工艺制备得到的三批样品，活性一致且稳定，
达到了正交实验设计的最佳水平
。
3.3SPS硫酸根含量的测定及取代度的换算
以
360nm处吸光值对硫元素含量做标准曲
线
，
为
Y=0.0535X+0.0429（r
2
=0.9903），根据回归方
程计算出硫元素百分含量为
12.78%，换算为硫酸基
取代度为
1.09。
表
1酵母葡聚糖硫酸酯化的正交试验
序
号
氯磺酸：
吡啶
（V/V）
反应温度
（℃）
反应时间
（h）
误
差
淋巴细胞
增殖率
（%）
11：
4402137.1
21：
4703268.23
31：
410043-10.6
41：
6403386.94
51：
6704185.16
6
7
8
9
1：
6
1：
8
1：
8
1：
8
100
40
70
100
1
4
2
3
2
2
3
1
3.23
64.44
46.05
24.6
K
1
K
2
K
3
R
31.57
58.44
45.03
26.87
66.48
66.83
5.74
61.09
28.79
59.92
46.33
31.13
表
2方差的分析
因素
偏差平
方和
自由度
F比
F临
界值
显著性
试剂比例
1373.6236.1319P＜0.05
反应温度
7339.462193.0319P＜0.05
反应时间
1781.67246.8619P＜0.05
误差
38.022119P＜0.05
药学与临床研究
PharmaceuticalandClinicalResearch
药学
研究
225SulfationforModificationofGlucanfromSaccharomycescervisiaeandIts
EnhancementofLymphocytesGrowth
NIEYu,WANGWen-yi,ZHOUFei,YINHong-ping
*
WANGMin
*
SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China
ABSTRACTObjective:
Tooptimizethemodificationconditionsforthepreparationofsulfatedglucan
fromSaccharomycescervisiae（SPS）withhighimmuneenhancementactivity.Methods:
SPSwasprepared
usingchlorosulfonicacid-pyridinemethodbyL
9
（3）
4
orthogonaldesign,immunomodulatoryactivityofSPS
wasexaminedbythelymphocytesexperiment.Results:
Theoptimizedconditionswerevolumeratioof
chlorosulfonicacidtopyridineat1：
6,reactiontemperatureat70℃andreactiontimefor3h.Thecontent
ofsulfurinSPSandthedegreeofsubstitution（D
s
）wereachievedtobe12.78%and1.09.Intherangeof
50～200μg·mL
-1
thelymphocytes-activatingactivitywassignificantlyenhancedbySPScomparedwith
controlgroup（P<0.01）,withthemeanproliferationrateat89.85%.Conclusion:
TheSPSpreparedbythe
proposedmethodhashighersulfurcontentandenhancestheproliferationrateoflymphocytesfromthe
spleenofICRmicesignificantly
KEYWORDSGlucan;Saccharomycescervisiae;Chlorosulfonicacid-pyridine;Lymphocytes
4讨论
本研究所要解决的技术问题是对酵母葡聚糖
进行结构修饰，将水不溶的葡聚糖转变为水溶性
的、有显著生物活性的葡聚糖，提供一种毒性低、成
本低的硫酸酯化酵母葡聚糖用于制备免疫增强剂
。
实验采用氯磺酸
-吡啶法，该方法用酯化试剂，简单
易得，反应条件温和，产物回收方便。
实验中应缓慢
滴加氯磺酸，否则生成的酯化试剂颜色加深，影响
反应效果
。
随氯磺酸比例增高，易出现板结，搅拌困
难。
本实验过程中发现，并非较高的氯磺酸比例、反
应温度及较长的反应时间得到的产物有较高的生
物活性。
原因可能是过于剧烈的反应条件易造成糖
链结构的破坏
，
引起多糖的降解等。
在最佳的工艺
条件下，即氯磺酸与吡啶的体积比1∶6，反应温度
70℃，反应时间3h，产物显著增强小鼠脾淋巴细胞
增殖
，平均增殖率可达89.85%，产物中硫的质量分
数和取代度分别达
12.78%和1.09。
多糖的硫酸化反应是在路易斯碱溶液中由
SO
3
H
+
取代多糖羟基中的
H
+
，经中和得到多糖硫酸
盐
[10]
。
硫酸酯化的多糖结构发生了变化，而这种变化
导致了理化性质及生物活性的改变
。
本实验以多糖
的免疫活性为导向，探索酵母葡聚糖活性修饰产物
的最佳制备工艺
，
为该多糖资源的利用和糖药物的
研究提供了基础
。
在以后的研究中可以进一步改良
工艺，以克服硫酸化试剂稳定性差、较难提高氯磺
酸比例等问题，并深入进行多糖分子构效关系及作
用机制的研究。
参考文献
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