Rab25在非小细胞肺癌厄洛替尼获得性耐药中的作用及机制研究肿瘤学专业毕业论文.docx

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第三军医大学硕士学位论文

第四章Wnt信号通路激活参与Rab25介导耐药的机制

人体Rab25主要表达在上皮细胞，在我们前面的实验中也通过细胞免疫荧光法确定PC9／ER细胞中高表达的Rab25蛋白主要定位于细胞膜。

然而我们感兴趣的是究竟Rab25这种膜蛋白是通过何种机制途径或者细胞信号通路参与到厄洛替尼获得性耐药的。

有报道称Rab25在肝癌细胞系中通过调控Wnt信号通路参与肿瘤的增殖、侵袭和转移特性[30]，在膀胱癌细胞中也能够通过调控Wnt通路中的p-GSK．3p进而促进细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）[3¨。

Wnt信号通路进化相对保守，其异常激活与人类众多肿瘤的发生发展相关【2】，其核心是IB-catenin在核内的集聚。

在Wnt信号通路在未被激活的情况下，13-catenin与轴蛋白Axin、APC、GSK一3p形成复合物通过泛素化途径降解，胞内游离的13-catenin极低。

而当Wnt通路激活时，复合物结构发生改变而失去泛素化底物活性，导致游离的13-catenin增高从而发生核移位并调控特定靶基因的转录【32]。

众所周知T790M突变是引起NSCLC厄洛替尼获得性耐药的重要原因，但其下游机制长期以来不尽明朗。

最新研究表明，在肺腺癌NCI．H1650细胞中，EGFR的突变特别是T790M突变能磷酸化并激活13-catenin，从而介导核内反式激活，进而导致细胞对厄洛替尼的敏感性下降【3]。

而敲低13-catenin的表达能够明显改善肺腺癌非敏感细胞H1975对不可逆性TKI（BIBW2992）的敏感性【4】。

这些证据表明，[3-catenin在TKI原发和继发性耐药中可能可能发挥了重要的作用。

而13-catenin在PC9／ER细胞中是否也是Rab25调控厄洛替尼耐药性的下游机制蛋白引起了我们的研究兴趣。

本部分实验拟利用慢病毒包裹载体敲减PC9／ER细胞中Rab25的表达，通过检测Wnt信号通路的蛋白变化，并应用文献报道的13-catenin激动剂（LiCl）进行恢复实验来验证Rab25对Wnt信号通路可能的调控作用，进一步明确Rab25参与厄洛替尼耐药的具体信号通路机制，为其在厄洛替尼获得性耐药中的作用提供新的证据。

4。

1实验材料

4．1．1实验试剂与仪器

主要试剂：

试剂名称厂家名称

SDS．PAGE上样缓冲液江苏碧云天公司

32

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PMSF江苏碧云天公司

胰蛋白消化酶江苏碧云天公司

PBS缓冲液武汉博士德公司

细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒江苏碧云天公司

LiCl美国Amresco公司

polybrene吉凯基因

Lv-Rab25一RNAi（44182．1）吉凯基因hU6·-MCS—·Ubiquitin-·EGFP--IRES--puromycin吉凯基因主要仪器：

仪器名称厂家名称

低温高速离心机美国Themo—Fisher公司

．80℃冰箱美国Themo—Fisher公司

荧光定量PCR仪美国Applied

凝胶成像化学发光系统美国Flourchem

全波长多功能酶标仪美国Themo

电子分析天平上海卓精

移液系统美国Qiagen

4．2实验方法

4．2．1贴壁细胞提核浆蛋白抽提l、取适量EP管放置冰箱．4"C预冷

2、取一EP管混1200I．tL细胞浆蛋白抽提试剂A加12此PMSF（100mM）；一EP管取60皿细胞浆蛋白抽提试剂B；一EP管混300此细胞核蛋白抽提试剂加PMSF（100mM）3此

3、将各瓶细胞依次用PBS溶液清洗两遍，用细胞刮子刮下细胞，并用EP管收集，

800rpm离心5min

4、尽量吸尽上清，细胞沉淀加入配好PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A200此，漩

涡振荡5s，冰上作用15min

5、每管加入配好PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂B10皿，漩涡振荡5s，冰上作用

1min

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6、漩涡振荡5s，4"Cxl40009离心5min，吸取上清200¨L至已预冷的EP管，每

管加入SDS．PAGE上样缓冲液50此，煮沸5min，放入．80。

C冻存7、完全吸尽上清，将沉淀中每管加入50此配好PMSF的细胞核蛋白抽提试剂

8、漩涡振荡30s，冰上作用2min，反复15回合

4。

U×140009离心10rain，每管吸取上清40此至预冷的EP管中，每管加入SDS．PAGE上样缓冲液10皿，煮沸5min，放入．80。

C冻存

4．2．2Westem．Blot实验方法同2．1．8

4．2．3LiCl溶液的配制与应用

1、用电子天平称取1．059759的LiCl粉末，溶于5mL的ddH20中，置于冰箱4℃冷藏，此浓度为5M

2、处理细胞时，将上述药液取10此加入到5mL的培养基中，此浓度为10mM

4．2．4慢病毒感染实验

1、用胰蛋白酶消化液消化PC9／ER细胞，800rpm×5min离心，弃上清。

2、细胞计数后以5x104个／mL的细胞悬液，在24孔板中每孑L种板500此，种植3

个孔。

3、用完全培养基分别配制各组感染液：

Rab25-RNAi组：

5013I此培养基+50LRab25一RNAi慢病毒（MOI=100）+0．25此

polybrane（终浓度5I．tg／mL）

阴性对照组：

500胁L培养基+5皿hU6-MCS-Ubiquitin—EGFP—IRES-puromycin慢病毒（MOI=00）+0．25止polybrane（终浓度5Ltg／mL）空白组：

500皿培养基+5此PBS慢病毒（MOI=100）+0．25皿polybrane（终浓度

599／mL）

4、8h细胞贴壁后吸出24孔板里的培养基，分别换上以上配制的感染液

5、72h以后再荧光显微镜下观察转染效率并成像保存。

4。

2．5细胞冻存

1、将细胞用胰蛋白酶消化液消化后，以800rpm离心5min

2、弃尽上清，用6009L培养基重悬

3、将以上细胞悬液吸至细胞冻存管，避光下每管再加入3001d。

血清和100肛LDMSO溶液

4、4"C保存30min，．20"C保存2h，在．80。

C过夜，最后转移到液氮罐中保存

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4．3研究结果

4．3．1Wnt通路在PC9及PC9／ER细胞中的差异我们利用Western—Blot检测PC9及PC9／ER细胞中wnt通路蛋白p-GSK-3p与

13-catenin的表情情况发现：

p-GSK一3B与13-catenin的表达在PC9／ER细胞中均高于PC9（图12）。

免疫荧光法检测显示：

PC9／ER细胞中增高的13-catenin蛋白则主要表达于

细胞核（图13），PC9／ER细胞13-catenin平均荧光度值高于PC9细胞（尸<0．05）（图

14）

p-c乱enin

P-GSK一3p

GAPDH

图12Wnt通路在PC9及PC9／ER细胞中蛋白表达差异

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DAPI13-cateninMerge

①U

色

ev'

UU

、～

西U

色

图13激光共聚焦扫描显微镜下显示[3-catenin蛋白

a10

扛N霎8斌墨6

C

．三4

m

g2

C卫

0

a：

P<0．05

图14半定量13-catenin平均荧光度值

4．3．2慢病毒感染观察荧光效率慢病毒感染72h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞的GFP（绿色）荧光表达情况，

与普通白光相比，可以看到有绿色荧光的细胞占到80～90％（图15）。

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卜卜o

C

o

U

_

≥

Un

ND

巾

比

●

≥

普通光镜（400×）荧光显微镜（400X）

图15慢病毒感染后的PC9／ER细胞

4．3．3敲减Rab25可以抑制Wm通路活性利用慢病毒感染的PC9／ER细胞为研究对象，Wstem．blot检测结果显示（图16），

在没有LiCI处理因素的情况下，敲低组（LV-Rab25）的Rab25、p-GSK．3B、[3-catenin蛋白的表达量均低于对照组（LV-Con077）。

这说明了Rab25在耐药细胞PC9／ER中的表达是与Wnt通路中的P．GSK．3B和[3-catenin的表达正相关的，提示可能具有一定的调控关系。

当在敲减组（LV-Rab25）中加入10mM的LiCl处理48h后，p-GSK一3B和13-catenin的表达则明显高于未加LiCl处理组，而Rab25的表达在两者之间没有明显变化。

提示Rab25可能在Wnt通路的上游对其发挥调控作用。

而在对照组（LV-Con077）中，由于Rab25的高表达已经激活了Wnt通路，LiCI的处理因素并没有明显的影响P．GSK．3B和13-catenin的表达。

这也进一步印证了LiCI对只能在Wnt通路失活的状态下发挥激动剂的作用。

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[3-catenin

P—GSK一3B

Rab25GAPDH

十+LV一阳b25

一一十+LV—Con077

十十一LiCl

图16Wstern．blot检测Wnt通路与Rab25的蛋白表达关系

核蛋白Wstern-blot检测结果显示Rab25的敲低能明显降低13-catenin的核表达，而LiCl能增加[3-catenin的核表达，对wnt通路具有恢复作用（图17）。

p-catenin

LaminB1

L、，_Rab25LV-Rab25LV-Con077

十L；Cl

图17Wstern-blot检测13-catenin的核表达

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4．4讨论

lS-catenin是一种表达在细胞浆内的糖蛋白，最初因其与E—cadhefin包内段连接而被发现，作为经典Wm信号通路的核心因子，其异常表达参与调控包括NSCLC在内的众多肿瘤的增殖、分化、转移等生物学行为。

有学者根据41例发生EGFR敏感突变的NSCLC病人临床病理资料分析发现，发生13-catenin突变病人对TKI的客观缓解率与总生存率都明显低于对照【331。

而[3-catenin也被证实是EGFR突变后参与调控NSCLC肿瘤细胞增殖、凋亡的下游信号通路，特别是在发生T790M突变的亚组中13-catenin的激活更明显【3]。

这些实验结果有力的提示了13-catenin的异常表达或者异常激活状态可能是NSCLC发生TKI获得性耐药的一种下游机制。

经典的Wnt信号通路主要由13-catenin、GSK．3D、APC、Axin等组成，他们组成的复合体在细胞胞浆内由泛素化途径降解而保持低水平状态[341。

当Wnt通路激活时Dsh蛋白通过磷酸化抑制GSK．3p的活性，导致复合物因结构改变避免了泛素化降解从而使p-catenin得到了异常积累（见图18）。

LiCI是一种常见的化合物，在医学上

是被用来治疗双向情感障碍和抑郁症的药物【35l。

在多种肿瘤研究中被证实可以通过抑

制GSK一3B而激活wnt通路，从而调控肿瘤的增殖进展等陋39】。

CanonicalWntSignaling

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B．c^lel-iI，dlt'cUnltll,lliOllm,Jj』I

39

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图18经典Wm信号通路示意图（引自Tejeda-MunozN，Robles．FloresM．Glycogen

synthasekinase3inwmsignalingpmhwayandcancer[J]．IUBMBLife，2015，67（12）：

914-922．）

本部分实验先通过在PC9／ER细胞中检测Rab25敲低后的Wnt通路关键蛋白的表达，发现随着Rab25的敲低P．GSK．3B、p-catenin的表达也随之下降，其中IB-catenin在核中的表达明显受到抑制。

而加入LiCl以后则对p-catenin的核表达有一定的恢复作用。

这些结果提示Rab25可能是通过调控13-catenin的表达与核移位来实现对厄洛替尼敏感性的影响的。

有报道称在人膀胱癌细胞EJ和T24中敲低Rab25能够导致p-GSK-313的表达下降，从而降低细胞的侵袭能力【31]。

这项实验结果提示Rab25在EJ和T24这两种肿瘤细胞中是能够通过磷酸化并激活GSK一3B的表达，从而导致因Axin,APC、GSK．3p、IB-catenin复合物结构改变而抑制泛素化降解的。

遗憾的是这项研究没有进一步检测细胞胞浆和

胞核内p-catenin的表达改变情况。

与这项研究对比，本实验虽然检测了胞浆和胞核内13-catenin的表达，也存在许多可以进一步完善的地方：

比如慢病毒干扰后加入LiCl因素缺少功能上的恢复实验；用双荧光素酶实验或者ColP实验验证Rab25与GSK．3p的直接作用关系；单独干扰GSK-313的表达再进行上下游蛋白表达的检测与细胞功能实验等。

此外，本研究仅限于细胞水平，未能完成整体动物实验（进行中）和临床标本检测。

而这些证据可以进一步增强Rab25调控的Wnt信号通路，在NSCLCEGFR-TKI继发耐药中发挥重要作用的说服力，也可以为未来的抗体设计甚至药物设计等转化医学课题奠定丰富的理论基础。

期望能有机会完善此研究。

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全文结论

1．本课题组诱导的PC9／ER细胞是研究厄洛替尼耐药的良好细胞模型。

2．Rab25是厄洛替尼耐药的重要分子改变之一，具有促进耐药的作用，可以作为厄洛替尼耐药检测的新指标。

3．Rab25可能是通过调控Writ信号通路介导厄洛替尼耐药的。

4l

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参考文献

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