dn连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法.docx

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dn连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法

DNA连接反应的影响因素&提高平端连接效率的方法&外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应&平端ＤＮＡ连接接反应

1、连接缓冲液的影响：

大体上缓冲液含有以下组分：

20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。

与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。

2、pH的影响：

一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。

有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。

3、ATP浓度的影响：

连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。

研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。

例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。

由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。

含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。

连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。

与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。

4、连接温度与时间的影响：

因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。

为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。

现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃60min能使连接反应进行得更完全一些。

对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。

5、酶浓度的影响：

日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。

进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。

6、DNA浓度的影响：

要求得到环化的有效连接产物，DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。

要求线性化的连接产物，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。

在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。

另据研究，T4DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。

即应具有2nmol/L的末端浓度。

提高平端连接效率的方法：

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。

这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

足够多的载体和插入片段是最重要的。

要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。

插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。

载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50－100ng。

3、平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4C过夜。

4、尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。

5、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应

　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。

如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。

但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。

在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入后可被修复。

相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。

实际上在有用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。

这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。

　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。

不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。

现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。

在瓜作用的底物。

如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。

这倦，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。

如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。

因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。

Dugaiczyk等（1975;同时参见BethesdaRes,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。

简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：

j和i。

j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：

沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。

这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。

j＝[3/（3πlb0）]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。

b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。

i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：

mol/L）。

理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。

因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。

而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。

图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:

i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。

现在考虑如下的连接反应混合物：

其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。

对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。

当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。

这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。

当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:

i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：

１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:

i>1和j:

i<3。

对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。

２）未端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。

这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。

如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹策略以便通过定向的方法构建重组质粒。

（二）粘端连接

１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。

如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。

通过酚：

氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE（pH7.6）溶液使其浓度为100/ml。

２）按如下所述设立连接反应混合物：

a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。

b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。

c．加入：

10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液１μl

Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶0.1Weiss单位

５mmol/LATP1μl

于16℃温育１－４小时

10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液

200mmol/L同Tris.Cl（pH7.6）

50mmol/KMgCl2

50mmol/L二硫苏糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）

该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。

另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。

如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。

可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。

大多数制造厂商（除NewEnglandBiolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968）对该酶进行标化。

１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970）或者60个粘端单位（如ＮewEnglandBiolabs公司所定义）。

因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。

在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。

par目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/LTris.Cl（pH7.6）、60mmol/LKCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。

处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。

３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌。

 （三）平端ＤＮＡ连接

　　Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。

有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。

然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：

１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP（Ferretti和Sgaranekka,1981）。

２）不存在亚精胺一类的多胺。

３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

４）高浓度的平端。

１．凝聚剂

　　在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanTＨarrison,1985）或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。

在连接反应中，这些物质具有两作用：

１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。

２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。

这样，即使在有利于自身环化（j:

i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。

par在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。

（１）聚乙二醇（PEG8000）

１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。

在含15％PEG8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。

除PEG800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。

２）连接混合物中含0.5mmol/LATP和5mmol/LMgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

３）浓度为15％的PEG8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。

４）PEG8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

（２）氯化六氨合高钴

１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。

当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。

氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

２）在单价阳离子（30mmol/LKCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。

连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。

３）与ＰＥＧ8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

一、转化

由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。

但DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。

例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔（electroporation）转化法。

二、感染

噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（infection）。

用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。

感染的效率很高，但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较麻烦。

三、转染

重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染（transfection）。

M13噬菌体DNA导入大肠杆菌就常用转染的方法。

重组DNA进入宿主细胞也常用转染方式。

最经典的是1973年建立的磷酸钙法，其利用的基本现象是：

DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时，培养细胞摄取DNA的效率会显著提高。

用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力，但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理细菌者都很不相同。

近年来用人工脂质膜包裹DNA，形成的脂质体（Liposome）可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞，方法简单而有效，现有商售的脂质体，使用日益广泛。