免疫荧光检测.docx

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免疫荧光检测

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）

荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。

荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。

荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。

荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。

本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体（ANA）为例进行实习。

抗核抗体（antinuclearantibody，ANA）又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。

抗核抗体实验原理

以小鼠肝细胞或某些培养细胞（如Hep-2）作抗原片，将病人血清加到抗原片上。

如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。

加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。

试剂与器材

1．抗原片现多用商品试剂。

如需自行制备，方法如下：

（1）肝印片制备：

取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。

将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。

将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。

冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。

（2）Hep-2细胞抗原片制备：

Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。

经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。

干燥后，用无水乙醇固定。

（3）肝切片制备：

取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。

-30℃保存备用。

2．异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人IgG抗体（FITC-抗人IgG抗体）有商品供应，临用时按效价稀释。

3．0.01mol/LpH7.2PBS

4．缓冲甘油取甘油9份加PBS1份。

5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。

6．器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等

操作方法

1．准备：

检查加样板，生物载片恢复室温，标记。

2．稀释：

PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。

3．加样：

加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。

加完所有标本后开始温育。

4．温育：

将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。

5．冲洗：

用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。

不必混摇。

6．加样：

滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。

荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

7．冲洗：

用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。

不必混摇。

8．封片：

将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：

每反应区约10μl。

从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。

还要擦拭反应区间隙。

将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。

然后继续下1张。

结果判定

荧光显微镜下观察

1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。

抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。

阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：

①均质型：

细胞核呈均匀一致的荧光；

②周边型（核膜型）：

细胞核周围呈现荧光；③斑点型（颗粒型）：

细胞核内呈现斑点状荧光；

④核仁型：

核仁部分呈现荧光。

⑤混合型：

两种以上核染色；

⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型（ACA）

注意事项

1．PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。

2．根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在4℃下可存放1周。

3．血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。

4．载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。

5．冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。

载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。

6．封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。

可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。

7．封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。

封好的载片可于4℃长期保存。

实验讨论

方法评价间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。

该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。

鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。

Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。

检测抗核抗体（ANA）的实验方案

ANA简介

抗核抗体（antinuclear antibodies，ANAs）

经典定义：

针对细胞核成分的一大组抗体谱。

抗核抗体新概念（FANA）

传统定义：

顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称®狭义定义

现代定义：

是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。

对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nucleicacid）和核蛋白（nucleoprotein）抗体的总称®广义定义

靶抗原分布：

细胞核

细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期

抗核抗体检测方法

检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIF

ANA检测方法进展：

仅限于IIF改良法（底物选择、制备方法）试图将ELISA发推广为最基本的筛选方法未获成功

复制细胞抗原全部成分极其困难®抗原存在的相对浓度、自然抗原决定簇的二级结构及高级结构

荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性

IIF法：

HEp-2细胞底物（90%以上实验室采用）

#完整的ANAs抗原谱（细胞核、浆、骨架、周期）

#可预测分析ANA靶抗原范围

#经验性强

ELISA法：

采用高度纯化抗原或全细胞抗原

#抗原谱有限（十余种）

# 假阴性结果

#操作简单快速

其他方法：

金标法、比浊法

ANA靶抗原

多核苷酸：

双链DNA、单链DNA、RNA

组蛋白：

H1，H2A，H2B，H3，H4，H2A-H2B复合物

核浆的核糖核蛋白:

U1-nRNP、Sm、SS-A（Ro）、SS-B（La）、Ku、Mi-1、Mi-2、核点、增殖性细胞核抗原…

核仁抗原：

Scl-70、U3-nRNP/原纤维蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl（PM-1）、7-2-RNP（To）、4-6-S-RNA、核仁形成中心（NOR）…

核膜抗原：

板层素（层粘连蛋白）

着丝点：

着丝点蛋白

……

ANA检出率

与年龄和性别有关

与个体的免疫稳定性相关

使用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些ANA。

_________天然ANA_________

生理性自身免疫

维持机体内环境的生理稳定。

滴度较低，亲和力弱，大多为IgM型。

ANA检测方法

初筛抗核抗体：

IIF

最佳基质：

联合生物薄片（HEp-2细胞/猴肝冰冻组织）

区分抗核抗体的靶抗原：

ELISA、印迹法和免疫印迹法

ANA初筛

IFT：

HEp-2细胞/灵长类肝脏

完整的抗原谱（细胞核及细胞浆）

可预测靶抗原

协助检测其它项目（如ANCA、ENA）

ELISA：

采用高度纯化的抗原初筛ANA

抗原谱有限

操作简单快速

采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验

为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术?

滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。

系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。

因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。

并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。

准备：

检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？

如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或ExtranMA01（默克公司），再用水彻底冲洗。

需要消毒时，可于3％的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。

只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。

不要触及生物薄片。

按照要求用记号笔对玻片进行标记。

稀释：

按照试剂盒使用说明稀释血清标本。

每次实验均需加入阳性和阴性对照。

对照血清使用前必须混匀。

加样：

在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。

滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。

使用聚苯乙烯加样板。

加样体积:

10µl/反应区（3x3mm）

25µl/反应区（5x5mm）

70µl/反应区（7x9mm）

温育：

将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。

确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。

室温温育30分钟。

清洗：

用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。

冲洗1秒钟

小杯内浸洗5分钟

加样：

将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。

完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。

使用连续加样器。

加样前应使用加样器混匀。

为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。

加样体积:

10µl/反应区（3x3mm）

20µl/反应区（5x5mm）

60µl/反应区（7x9mm）

温育：

从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。

注意：

为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。

检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。

从现在开始，注意避免阳光直射载片。

室温温育30分钟。

清洗：

用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。

可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴（150µl）伊文氏蓝进行复染。

冲洗1秒钟

小杯内浸洗5分钟

封片：

在盖玻片上滴加甘油/PBS。

使用聚苯乙烯封片板。

从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。

将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。

然后再进行下一个载片的操作。

封片体积:

10µl/反应区（3x3mm）

10µl/反应区（5x5mm）

20µl/反应区（7x9mm）

结果判断：

荧光显微镜下观察荧光。

具体操作

荧光工作台的布置

清洗

载片的擦拭

封片

ANA的结果

间接免疫荧光法的独特优势（一种基质–可筛查上百种不同的抗体）

用HEp-2细胞检测自身抗体

ANA荧光模型

核均质型

核仁型

核颗粒型

胞浆型

ANA确认实验

（1）

IFT:

-HEp-2细胞/灵长类肝脏：

特殊的荧光模型

如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白

ELISA:

-ANA分项（含ENA谱）:

包被高度纯化抗原

斑点法/印迹法

-ENA谱:

采用各种高度纯化的抗原

ELISA：

抗ENA谱

印迹法：

抗ENA谱

印迹法：

抗ENA谱

免疫印迹法

ANA确认实验

（2）

Westernblot:

HEp-2细胞提取物

- 定性

- 适宜特别需要（如区分靶抗原Ro52或Ro60）

- 检测目前无法纯化的靶抗原的抗体（如PM-Scl、Ku）

结论

初筛实验：

免疫荧光技术（HEp-2细胞/灵长类肝脏）

ELISA （纯化的多种核抗原）

确认实验：

ELISA

印迹法

斑点法

Westernblot

ANA谱与相关疾病

相关性：

ssDNA

类风湿 80.8%

SLE 40.0%

干燥综合征 44.0%

皮肌炎 12.3%

类风湿性关节炎 51.7%

献血员 6.8%

SLE 30%-90%

抗dsDNA：

绿蝇短膜虫

组蛋白

靶抗原：

组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4

（主要抗原H1和H2B）

功能：

形成核小体

相关性：

药物诱导性LE:

100%（唯一的标志抗体）

SLE：

40%-80%

其它风湿性疾病：

少见

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗RNP/Sm

U1-nRNP

靶抗原：

与U1-nRNA连接的3个蛋白分子（70K、A和C蛋白）

功能：

切割pre-mRNA

相关性：

MCTD:

95%-100%

SLE:

15%-40%

抗Sm抗体

靶抗原：

与U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA 连接的6种不同蛋白分子

（coreproteinsB,B´,D,E,F,G）

功能：

切割pre-mRNA

相关性：

SLE:

5%-30%

HEp-2细胞/灵长类肝脏:

抗核糖体P蛋白

抗核糖体P蛋白抗体

抗原：

核糖体的亚单位（60S）,3个蛋白分子组成:

P0、P1、P2（38、19、17kDa）。

在碳末端具有相似的免疫反应表位。

功能：

蛋白合成易位过程中的辅蛋白

相关性：

SLE：

5%-15%

原发性干燥综合征的抗体谱

靶抗原阳性率（%）

SS-A 40-95

SS-B 40-95

ssDNA 40-95

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗SS-A/SS-B

抗SS-A抗体

靶抗原：

与Y1,Y3,Y4或Y5型RNA连接的2个蛋白（52kDa和60kDa）

功能：

调节mRNA的转译活性

相关性：

干燥综合征：

40%-95%

SLE:

20%-60%

抗SS-B抗体

靶抗原：

与小分子RNA（U6-RNA,pre-tRNA）结合的磷脂蛋白（48kDa）

功能：

RNA多聚酶III的辅蛋白

相关性：

干燥综合征：

40%-95%

SLE:

10%-20%

进行性系统性硬化征的抗体谱

靶抗原阳性率（%）

着丝点 80-95

Scl-70 25-75

ssDNA 30-60

原纤维蛋白 5-10

RNA聚合酶 4

PM-Scl（重叠综合征） 3

NOR-90（核仁形成区）少见

Ku（多肌炎型重叠综合征） 1-7

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗着丝点抗体

靶抗原：

连接动粒（着丝点）上的4个蛋白分子：

A-、B-、C-、D-蛋白，分子量（17、80、140、50kDa）

主要的靶抗原：

着丝点B蛋白（与IIFT相关性：

100%）

功能：

与纺锤体纤维连接

相关性：

硬皮病：

18%

局限性硬化征（CREST综合征）:

80%-95%

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗Scl-70

抗Scl-70抗体

靶抗原：

DNA拓扑异构酶I（100kDa）

功能：

DNA复制和翻译过程的辅蛋白

相关性：

硬皮病：

25%-75%

HEp-2/灵长类肝脏：

抗PM-Scl

抗PM-Scl抗体

靶抗原：

多个蛋白分子的复合物

主要的靶抗原100kDa

（与DNA拓扑异构酶I不同）

功能：

未知

相关性：

硬皮病：

2%-5%

肌炎：

重叠综合征：

24%

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗RNA多聚酶

RNA多聚酶I、II和III

靶抗原：

多个蛋白亚单位组成的核仁酶复合物

功能：

多聚酶I:

转录rRNA基因

多聚酶II:

转录mRNA基因

多聚酶III:

转录tRNA基因

相关性：

硬皮病：

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗原纤维蛋白

抗原纤维蛋白（U3-nRNP）抗体

靶抗原：

与基础蛋白（34kDa）连接的U3-nRNA和其它5个蛋白

功能：

分离pre-rRNA

相关性：

皮肌炎：

5%-10%

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗NOR

HEp-2细胞/灵长类肝脏：

抗Ku

多肌炎和皮肌炎的抗体谱

靶抗原

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