免疫荧光检测Word文件下载.docx
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加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应
区，避免气泡。
加完所有标本后开始温育。
4．温育：
将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。
5．冲洗：
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有
PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。
不必混摇。
6．加样：
滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应
区，完全加完方可继续温育。
荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液
稀释。
7．冲洗：
8．封片：
将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：
每反应区约10μl。
从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。
还要擦拭反应区间隙。
将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。
然后继续下1张。
结果判定
荧光显微镜下观察
1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。
抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。
阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：
①均质型：
细胞核呈均匀一致的荧光；
②周边型（核膜型）：
细胞核周围呈现荧光；
③斑点型（颗粒型）：
细胞核内呈现斑点状荧光；
④核仁型：
核仁部分呈现荧光。
⑤混合型：
两种以上核染色；
⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型（ACA）
注意事项
1．PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。
2．根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可
在4℃下可存放1周。
3．血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。
4．载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。
5．冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。
载片上的反应区应保持湿润，不要
将载片风干。
6．封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。
可左右挪动盖玻片以使其正确嵌
入载片凹槽里。
7．封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。
封好的载片可于4℃长期保存。
实验讨论
方法评价间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。
该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。
鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。
Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫
病十分有利。
检测抗核抗体（ANA）的实验方案
ANA简介
抗核抗体（antinuclearantibodies，ANAs）
经典定义：
针对细胞核成分的一大组抗体谱。
抗核抗体新概念（FANA）
传统定义：
顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称?
狭义定义
现代定义：
是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。
对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nucleicacid）和核蛋白（nucleoprotein）抗体的总称?
广义定义
靶抗原分布：
细胞核
细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分
裂周期
抗核抗体检测方法
检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIF
ANA检测方法进展：
仅限于IIF改良法（底物选择、制备方法）试图将ELISA发推广
为最基本的筛选方法未获成功
复制细胞抗原全部成分极其困难?
抗原存在的相对浓度、自然抗原决定簇的二级结构及高级结构
荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性
IIF法：
HEp-2细胞底物（90%以上实验室采用）
#完整的ANAs抗原谱（细胞核、浆、骨架、周期）
#可预测分析ANA靶抗原范围
#经验性强
ELISA法：
采用高度纯化抗原或全细胞抗原
#抗原谱有限（十余种）
#假阴性结果
#操作简单快速其他方法：
金标法、比浊法
ANA靶抗原
多核苷酸：
双链DNA、单链DNA、RNA
组蛋白：
H1，H2A，H2B，H3，H4，H2A-H2B复合物
核浆的核糖核蛋白:
U1-nRNP、Sm、SS-A（Ro）、SS-B（La）、Ku、Mi-1、Mi-2、核点、增殖性细胞核抗原,
核仁抗原：
Scl-70、U3-nRNP/原纤维蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl（PM-1）、7-2-RNP（To）、4-6-S-RNA、核仁形成中心（NOR）,
核膜抗原：
板层素（层粘连蛋白）
着丝点：
着丝点蛋白
,
ANA检出率
与年龄和性别有关
与个体的免疫稳定性相关
使用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些ANA。
_________天然ANA_________
生理性自身免疫
维持机体内环境的生理稳定。
滴度较低，亲和力弱，大多为IgM型。
ANA检测方法
初筛抗核抗体：
IIF
最佳基质：
联合生物薄片（HEp-2细胞/猴肝冰冻组织）
区分抗核抗体的靶抗原：
ELISA、印迹法和免疫印迹法
ANA初筛
IFT：
HEp-2细胞/灵长类肝脏
完整的抗原谱（细胞核及细胞浆）
可预测靶抗原
协助检测其它项目（如ANCA、ENA）
ELISA：
采用高度纯化的抗原初筛ANA
抗原谱有限
操作简单快速
采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验
为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术?
:
滴加标本或标记抗体至加样板的
反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均
与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限
在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
准备：
检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？
如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时
可使用家用洗涤剂或ExtranMA01（默克公司），再用水彻底冲洗。
需要消毒时，可于3％
的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。
只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。
不要触及生物薄片。
按照要求用记号笔对玻片进行标记。
稀释：
按照试剂盒使用说明稀释血清标本。
每次实验均需加入阳性和阴性对照。
对照血清使用前必须混匀。
加样：
在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。
滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。
使用聚苯乙烯加样板。
加样体积:
10μl/反应区（3x3mm）
25μl/反应区（5x5mm）
70μl/反应区（7x9mm）
温育：
将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。
确保每个标本均能够与生物薄
片相接触，而标本之间不相互接触。
室温温育30分钟。
清洗：
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。
冲洗1秒钟
小杯内浸洗5分钟
将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。
完
全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。
使用连续加样器。
加样前应使用加样器混匀。
为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。
20μl/反应区（5x5mm）
60μl/反应区（7x9mm）
从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和
边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。
注意：
为防止破坏
基质，不要擦拭反应区的间隙。
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。
从
现在开始，注意避免阳光直射载片。
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴（150μl）伊文氏蓝进行复染。
封片：
在盖玻片上滴加甘油/PBS。
使用聚苯乙烯封片板。
从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。
将载片的生物薄片
朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。
然后再进行下一个载片的操作。
封片体积:
10μl/反应区（5x5mm）
20μl/反应区（7x9mm）
结果判断：
荧光显微镜下观察荧光。
具体操作
荧光工作台的布置
清洗
载片的擦拭
封片
ANA的结果
间接免疫荧光法的独特优势（一种基质–可筛查上百种不同的抗体）
用HEp-2细胞检测自身抗体
ANA荧光模型
核均质型
核仁型
核颗粒型
胞浆型
ANA确认实验
（1）
IFT:
-HEp-2细胞/灵长类肝脏：
特殊的荧光模型
如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白
ELISA:
-ANA分项（含ENA谱）:
包被高度纯化抗原
斑点法/印迹法
-ENA谱:
采用各种高度纯化的抗原
ELISA：
抗ENA谱
印迹法：
免疫印迹法
ANA确认实验
（2）
Westernblot:
HEp-2细胞提取物
-定性
-适宜特别需要（如区分靶抗原Ro52或Ro60）
-检测目前无法纯化的靶抗原的抗体（如PM-Scl、Ku）
结论
初筛实验：
免疫荧光技术（HEp-2细胞/灵长类肝脏）
ELISA（纯化的多种核抗原）
确认实验：
ELISA
印迹法
斑点法
Westernblot
ANA谱与相关疾病
相关疾病的ANA谱
ANA的各种荧光模型、靶抗原及相关性
高滴度的ANA仅出现在自身免疫性疾病中
自身免疫性疾病
ANA阳性率（％）
系统性红斑狼疮
活动期
95－100
非活动期
80－100
药物诱导的红斑狼疮
100
混合性结缔组织病
类风湿性关节炎
20－40
进行性系统性硬化症
20－50
多发性肌炎及皮肌炎
85－95
干燥综合征30－50
慢性活动性肝炎
70
－80
溃疡性结肠炎
－
80
其它风湿病
26
SLE抗核抗体的检出率
靶抗原
检出率（%）
dsDNA
30-90
Sm
5-30
核糖体P蛋白
5-15
周期蛋白I（PCNA）
3
ssDNA
70-95
组蛋白
40-80
U1-nRNP
15-40
SS-A
20-60
SS-B
10-20
Ku
5-10
心磷脂、b2-GP1
20-40
抗细胞抗体荧光模型（immunofluorescentpattern）
常见的荧光染色模型有6种：
核均质型（homogeneouspattern，H）
核颗粒型（Granuloguspattern，S）
核仁型（nucleouspattern，N）
核膜型（membranouspattern，M）
着丝点型（centromertpattern，ACA）
胞浆型（cytoplasmicpattern，ACYA）
HEp-2细胞/灵长类肝脏：
ssDNA/dsDNA
靶抗原：
单链、非天然DNA（嘌呤和嘧啶硷基对）
双链、天然DNA（脱氧核糖核酸结构）
相关性：
ssDNA
类风湿80.8%
SLE40.0%
干燥综合征44.0%
皮肌炎12.3%
类风湿性关节炎51.7%
献血员6.8%
SLE30%-90%
抗dsDNA：
绿蝇短膜虫
组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4
（主要抗原H1和H2B）
功能：
形成核小体
药物诱导性LE:
100%（唯一的标志抗体）
SLE：
40%-80%
其它风湿性疾病：
少见
抗RNP/Sm
与U1-nRNA连接的3个蛋白分子（70K、A和C蛋白）
切割pre-mRNA
MCTD:
95%-100%
SLE:
15%-40%
抗Sm抗体
与U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA连接的6种不同蛋白分子
（coreproteinsB,B,D,′E,F,G）
SLE:
5%-30%
HEp-2细胞/灵长类肝脏:
抗核糖体P蛋白
抗核糖体P蛋白抗体
抗原：
核糖体的亚单位（60S）,3个蛋白分子组成:
P0、P1、P2（38、19、17kDa）。
在碳末端具有相似的免疫反应表位。
蛋白合成易位过程中的辅蛋白
SLE：
5%-15%
原发性干燥综合征的抗体谱
靶抗原阳性率（%）
SS-A40-95
SS-B40-95
ssDNA40-95
HEp-2细胞/灵长类肝脏：
抗SS-A/SS-B
抗SS-A抗体
与Y1,Y3,Y4或Y5型RNA连接的2个蛋白（52kDa和60kDa）
调节mRNA的转译活性
干燥综合征：
40%-95%
20%-60%
抗SS-B抗体
与小分子RNA（U6-RNA,pre-tRNA）结合的磷脂蛋白（48kDa）
RNA多聚酶III的辅蛋白
10%-20%
进行性系统性硬化征的抗体谱
着丝点80-95
Scl-7025-75
ssDNA30-60
原纤维蛋白5-10
RNA聚合酶
4
PM-Scl（重叠综合征）
NOR-90（核仁形成区）少见
Ku（多肌炎型重叠综合征）1-7
抗着丝点抗体
连接动粒（着丝点）上的4个蛋白分子：
A-、B-、C-、D-蛋白，分子量
（17、80、140、50kDa）
主要的靶抗原：
着丝点B蛋白（与IIFT相关性：
100%）
与纺锤体纤维连接
硬皮病：
18%
局限性硬化征（CREST综合征）:
80%-95%
抗Scl-70
抗Scl-70抗体
DNA拓扑异构酶I（100kDa）
DNA复制和翻译过程的辅蛋白
25%-75%
HEp-2/灵长类肝脏：
抗PM-Scl
抗PM-Scl抗体
多个蛋白分子的复合物主要的靶抗原100kDa
（与DNA拓扑异构酶I不同）功能：
未知
2%-5%
肌炎：
8%
重叠综合征：
24%
抗RNA多聚酶
RNA多聚酶I、II和III
多个蛋白亚单位组成的核仁酶复合物
多聚酶I:
转录rRNA基因
多聚酶II:
转录mRNA基因
多聚酶III:
转录tRNA基因
4%
抗原纤维蛋白
抗原纤维蛋白（U3-nRNP）抗体
与基础蛋白（34kDa）连接的U3-nRNA和其它5个蛋白
分离pre-rRNA
皮肌炎：
5%-10%
抗NOR
抗Ku
多肌炎和皮肌炎的抗体谱
ssDNA40-50
Jo-1
25-35
8
Mi-2
5
Ku（带硬皮病的重叠综合征）
1-7
PL-7、PL-12、OJ、EJ、KJ
2-3
HEp-2细胞/灵长类肝脏:
抗Jo-1
组氨酰tRNA合成酶（50kDa）
细胞浆磷脂蛋白
将氨基酸与相应的tRNA连接
多肌炎、皮肌炎25%-35%
伴有肺间质纤维化的多肌炎70%
原发性胆汁性肝硬化的自身抗体谱
阳性率（%）
AMAM2
85-95
AMAM4
40-60
AMAM9
35
Sp-100
（nucleardots）30
Actin10-20
抗线粒体
抗AMAM2抗体
含3个不同的酰基转移酶的多酶复合物:
-丙酮酸脱氢酶（74kDa）
-2-酮酸脱氢酶（50kDa）
-2-酮戊酸脱氢酶（50kDa）
蛋白X（52kDa）,与丙酮酸脱氢酶复合物相关
PBC:
85%-95%
核点型
HEp-2细胞/大鼠肾:
核点型/AMA
着丝点+核点型
抗肌动蛋白
抗核膜型
联合a生物薄片（HEp-2/猴肝冰冻组织切片）检测到的一些少见的特殊的荧光模型
与细胞周期相关的荧光模型
抗周期蛋白I
抗周期蛋白II
中心粒
纺锤体纤维
HEp-
升级会员 