间接免疫荧光法测ANA.ppt

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间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）,制作人：

XXX20XX-XX-XX,抗核抗体,【自身抗体】：

指抗自身组织、器官、细胞及其成分的抗体【ANA】：

指抗细胞核成分（DNA，RNA，蛋白质和酶）的抗体。

ANA存在一个谱ANA新概念：

抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内更丰富,ANA检测的意义,有助于疾病的诊断如抗Sm是SLE标记抗体；抗ScL-70是SD的标记抗体；抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；观察疾病活动度和治疗反应研究发病机理,【ANA分类】,抗DNA（dsDNA,ssDNA）抗组蛋白（Histone）抗非组蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）,几种ENA的由来及同义词,Sm：

病人名：

SmithRNP:

u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:

ROSjogrenssyndromeASSB:

La,Ha,SjogrenssyndromeBJo-1:

病人JohnScL-70:

Scleroderma,【ANA由来】,中性粒细胞,DNP（DNA-Histone）+抗DNP+补体,均质体,LE细胞,LE细胞：

并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药物过敏，慢活肝等亦可阳性。

抗DNP取代LE细胞的检测,+,ANA的筛选：

间接免疫荧光法,ANA的筛选：

间接免疫荧光法,实验原理：

生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类特异性抗体可以与抗核抗原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并可在荧光显微镜下观察。

实验原理：

生物薄片马赛克TM技术,【实验步骤】,实验步骤一：

准备,检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？

如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。

需要消毒时，可于3的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。

只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。

不要触及生物薄片。

按照要求用记号笔对玻片进行标记。

实验步骤二：

样品准备,1:

100稀释血清标本。

每次实验均需加入阳性和阴性对照。

对照血清使用前必须混匀。

实验步骤三：

加样,在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。

滴加完所有待测标本后才开始温育。

使用聚苯乙烯加样板。

加样体积:

25l/反应区（5x5mm）,实验步骤四：

孵育,将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。

确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。

室温（18-25）温育30分钟。

实验步骤五：

冲洗,用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。

实验步骤六：

加样,将20l荧光标记的抗人球蛋白（荧光二抗）加入洁净加样板的每个反应区。

完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。

建议使用连续加样器。

加样前应使用加样器混匀。

为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。

实验步骤七：

孵育,从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。

注意：

为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。

检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。

从现在开始，注意避免阳光直射载片。

室温温育30分钟。

实验步骤八：

冲洗,用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。

可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴（150l）伊文氏蓝进行复染。

实验步骤九：

封片,在盖玻片上滴加甘油/PBS。

封片体积:

10l/反应区（5x5mm）从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。

将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。

然后再进行下一个载片的操作。

实验步骤十：

结果判断,荧光显微镜下观察荧光。

结果判读：

荧光显微镜下观察细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。

抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。

阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

【均质型】细胞核呈均匀一致的荧光,【核仁型】核仁部分呈现荧光,【斑点型】（颗粒型）细胞核内呈现斑点状荧光,【胞浆型】,【着丝点型】,混合型：

存在两种以上的类型,混合型：

存在两种以上的类型,滴度定义：

与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度,【临床意义】,总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。

绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。

ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。

未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%100%。

药物性狼疮100%、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。

干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎等。

活动性SLE（95-100%）非活动性SLE（80-100%）药物诱导的红斑狼疮（100%）混合结缔组织病（100%）类风湿关节炎（20-40%）其他风湿性疾病（20-50%）进行性系统硬化症（85-95%）多肌炎、皮肌炎（30-50%）干燥综合征（70-80%）慢性活动性肝炎（30-40%）溃疡性结肠炎（26%）,ThankYou!