实时荧光定量pcr实验报告.docx

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实时荧光定量pcr实验报告

实时荧光定量pcr实验报告

篇一：

实时荧光定量PCR方式简介

　　实时荧光定量PCR方式简介

　　一．实时荧光定量PCR的大体原理

　　理论上，PCR进程是依照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反映进程中，随着反映的进行由于体系中各成份的消耗（主若是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增加进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有靠得住的相关性。

如采纳常规的终点检测法（利用EB染色来判定扩增产物的多少，从而间接的判定起始拷贝量），即便起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能取得不同的终点荧光信号强度。

　　为了能准确判定样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采纳新的参数——Ct值，定量的全然原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

　　Ct值是如何取得的

　　在实时荧光定量PCR的进程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程搜集荧光信号，实验终止后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而取得每一个样品的Ct值。

　　Ct值的概念

　　Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增进程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也能够明白得为扩增曲线与阈值线交点所对

　　应的横坐标。

　　Ct值与样品中模板的对应关系

　　Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

　　与终点法相较利用Ct值的优势

　　由于Ct值是反映实际PCR反映进程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的阻碍，因此利用Ct值判定的起始模板拷贝数加倍精准，重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判定扩增产物的多少，从而间接的判定起始拷贝量，这种方式的精准度不高、重复性也不行。

以下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反映体系、相同的反映protocol、相同的样品起始浓度），能够看到Ct值具有专门好的重复性，而终点的荧光信号强度不同达到300个单位。

　　另外，采纳实时荧光定量PCR还能从方式学上有效的避免PCR实验中交叉污染的问题。

因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可取得定量结果，

　　直接抛弃含有大量扩增产物的反映管，完全幸免了传统方式中掏出扩增产物进行电泳鉴按时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。

　　二．荧光定量PCR的2类方式（按荧光产生的原理分类）染料法（SYBRGreen法）

　　染料法即利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。

该方式与常规的PCR类似，唯一的区别是在反映体系中加入了SYBRGreen染料分子。

该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。

与EB的性能类似，SYBRGreen也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反映体系中存在dsDNA时，SYBRGreen能特异性的与之结归并在497nm激发下。

　　染料法的优势：

1，无需设计、合成探针，实验本钱低；2，利用方便，与常规PCR的操作几乎相同。

　　染料法的缺点：

1，由于SYBR

Green与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增进程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。

因此采纳该方式关于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反映进程中没有非特异性产物的扩增；2，由于SYBRGreen的上述特点，该方式不能应用于MultiplexQPCR技术。

（在一个反映管中同时检测多个目的基因的表达情形）

　　探针法（以TaqMan探针为例）

　　探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同的地方在于：

在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针依照需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相较提高了实验的特异性。

目前市场上的探针要紧种类有：

TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最普遍。

TaqMan探针的结构：

长度与一般PCR引物类似，大约20bp左右。

在5’与3’端各标记有一个荧光基团，5’的荧光基团称为报告基团（Report），3’的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。

　　TaqMan探针的性能：

在探针结构完整的情形下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）将同意的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并非发射特定波长的荧光信号。

　　TaqMan探针法工作原理：

　　?

变性（95°C）：

模板dsDNA充分解链；

　　?

复性、延伸、酶切降解（60°C）：

1，探针与靶序列结合；上、下游引物与靶序列结合；

　　3，上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5’→3’聚合功能）；4，当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时，延伸不能继续，现在Taq酶发挥5’→3’外切功能将探针一一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；

　　?

荧光信号的检测：

由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作

　　用将同意的能量转移给淬灭基团，因此能够检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。

　　与染料法相较TaqMan探针法的优势：

1，实验的特异性取得了提高；2，对探针的5’端采纳不同的荧光标记就能够够进行MultiplexQPCR。

　　与染料法相较TaqM

an探针法的缺点：

1，探针的利用提高了实验本钱；2，探针的利用需要设计及优化。

　　三．确信样品起始模板拷贝数的2类方式

　　绝对定量

　　采纳绝对定量的方式需要利用标准品（已知起始拷贝数的样品）成立标准曲线，成立Ct值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。

　　标准品的种类：

含目的基因的质粒（经酶切线性化处置，其中的插入片段必需采纳与QPCR实验中相同的引物扩增取得）、PCR扩增产物（经纯化，必需采纳与QPCR实验中相同的引物扩增取得）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品利用较为普遍。

标准品的定量：

UVA260、荧光分光光度检测等。

　　为了使实验最终取得的Ct值之间具有可比性，必需进行归一化的处置：

1，对各样品进行

　　细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后取得的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。

相对定量

　　与绝对定量不同，相对定量不关切每一个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的不同化表达。

就研究目的而论，该方式比绝对定量的应用范围更普遍、更符合研究的目的。

某目的基因在样品与对照品间表达不同倍数的计算公式如下：

　　公式说明：

　　Rel.Quantity：

目的基因在样品与对照品间表达不同的倍数；

　　GOI：

目的基因（GeneofInterest）；

　　Norm：

内参基因（ReferenceGene，Normalizer，HouseKeepingGene）

　　Eff：

PCR扩增效率，分子部份为目的基因扩增效率，分母部份为内参基因的扩增效率；利用该公式时，需要通过实验别离确信目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；若是目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默以为100%，如此公式就简化为2-ΔΔCt。

　　?

什么缘故需要设立内参基因？

　　若是仅仅比较目的基因的ΔCt是不能准确反映样品间目的基因的表达不同的，最主若是受到3个变量的阻碍：

1，样品处置时不同的纯化得率；2，RT-PCR进程中不同的逆转录效率；3，QPCR反映体系中不同的cDNA加入量。

由于上述3个变量在样品间都很难操纵在相同的水平上，因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处置，使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，如此得出的结果才具有可信性与良好的重复性。

（注意：

内参基因的（1+EffΔCt）位于分母的位置，进行除法的运算。

）

　　?

如何选择内参基因？

符合什么标准的基因能够作为内参基因？

　　由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必需知足以下3个条件：

1，在不同的细胞、组织中具有恒定的表达；2，在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；3，在不同的实验状态下具有恒定的表达。

内参基因的ΔCt一样小于2（即小于1倍的表达不同），一样采纳的内参基因都是一些管家基因，利用最多的为：

?

-actin、GAPDH、18sRNA等。

　　需要注意的是：

并非传统意义上的管家基因都能作为内参基因，仍是需要与具体的实验结合起来综合考虑。

例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达，不能作为内参基因。

因此在选择内参基因时建议：

1，查阅相关文献；2，设立多个内参基因；3，采纳表达谱的方式确信理想的内参基因。

　　?

采纳Singleplex仍是Multiplex？

篇二：

实时荧光定量PCR具体实验步骤

　　以下实验步骤仅供参考：

　　1样品RNA的抽提

　　①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

　　②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动猛烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下1XXrpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为基层的红色酚氯仿相，中间层和无色水相上层。

RNA全数被分派于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

　　③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下1XXrpm离心10分钟。

现在离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

　　④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

　　⑤RNA干燥警惕吸去大部份乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

　　⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几回，使其完全溶解，取得的RNA溶液保留于-80℃待用。

　　2RNA质量检测

　　1）紫外吸收法测定

　　先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:

100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

　　①浓度测定

　　A260下读值为1表示40μg

RNA/ml。

样品RNA浓度（μg/ml）计算公式为：

A260×稀释倍数×40μg/ml。

具体计算如下：

　　RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:

100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21

　　RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl

　　取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：

　　35μl×0.84μg/μl=29.4μg

　　②纯度检测

　　RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

　　2）变性琼脂糖凝胶电泳测定

　　①制胶

　　1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）。

　　10×MOPS电泳缓冲液

　　浓度成份

　　0.4MMOPS，pH7.0

　　0.1M乙酸钠

　　0.01MEDTA

　　灌制凝胶板，预留加样孔至少能够加入25

μl溶液。

胶凝后取下梳子，将凝胶板

　　放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②预备RNA样品

　　取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。

加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

　　③电泳

　　上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。

5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

　　④紫外透射光下观看并拍照

　　28S和18S核糖体RNA的带超级亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观看到一个更小略微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18S和28S核糖体带之间能够看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备进程中若是显现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面显现，即更高分子量的弥散迁移物质或带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

用数码照相机拍下电泳结果。

　　3样品cDNA合成

　　①反映体系

　　序号反映物剂量

　　1逆转录buffer2μl

　　2上游引物0.2μl

　　3下游引物0.2μl

　　4dNTP0.1μl

　　5逆转录酶MMLV0.5μl

　　6DEPC水5μl

　　7RNA模版2μl

　　8整体积10μl

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，掏出后当即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

　　③掏出后当即95℃干浴3分钟，取得逆转录终溶液即为cDNA溶液，保留于-80℃待用。

　　4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

　　①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反映前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至10九、10八、107、10六、10五、104，以备用。

　　②反映体系如下：

　　标准品反映体系

　　序号反映物剂量

　　1SYBRGreen1染料10μl

　　2阳性模板上游引物F0.5μl

　　3阳性模板下游引物R0.5μl

　　4dNTP0.5μl

　　5Taq酶1μl

　　6阳性模板DNA5μl

　　7ddH2O32.5μl

　　8整体积50μl

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　管家基因反映体系：

　　序号反映物剂量

　　1SYBRGreen1染料10μl

　　2内参照上游引物F0.5μl

　　3内参照下游引物R0.5μl

　　4dNTP0.5μl

　　5Taq酶1μl

　　6待测样品cDNA5μl

　　7ddH2O32.5μl

　　8整体积50μl

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反映条件为：

93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。

　　5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

　　①针对每一需要测量的基因，选择一确信表达该基因的cDNA模板进行PCR反映。

　　反映体系：

　　序号反映物剂量

　　110×PCR缓冲液2.5ul

　　2MgCl2溶液1.5ul

　　3上游引物F0.5ul

　　4下游引物R0.5ul

　　5dNTP混合液3ul

　　6Taq聚合酶1ul

　　7cDNA1ul

　　8加水至整体积为25ul

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72oC延伸5分钟。

②PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是不是为单一特异性扩增条带。

　　③将PCR产物进行10倍梯度稀释:

将PCR产物进行10倍梯度稀释:

设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至10九、10八、107、10六、10五、104几个浓度梯度。

6待测样品的待测基因实时定量PCR

　　①所有cDNA样品别离配置实时定量PCR反映体系。

　　体系配置如下：

　　序号反映物剂量

　　1SYBRGreen1染料10ul

　　2上游引物1ul

　　3下游引物1ul

　　4dNTP1ul

　　5Taq聚合酶2ul

　　6待测样品cDNA5ul

　　7ddH2O30ul

　　8整体积50ul

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　②将配制好的PCR反映溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反映。

反映条件为：

93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

　　7实时定量PCR利用引物列表

　　引物设计软件：

PrimerPremier

5.0，并遵循以下原那么：

引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间幸免形成稳固的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反映（即错配）。

　　8电泳

　　各样品的目的基因和管家基因别离进行RealtimePCR反映。

PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView?

染色，检测PCR产物是不是为单一特异性扩增条带。

篇三：

生物实验4实时定量PCR实验报告

　　实验四定量PCR扩增

　　姓名：

李宗翰专业：

环境工程学号：

1432999同组人姓名：

刘雪飞

　　一、实验目的

　　温习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程

　　二、实验原理

　　实时荧光定量PCR是在PCR反映体系中加入荧光基团，利用荧光信号积存

　　实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方式。

在

　　PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过

　　Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

　　三、实验仪器及材料

　　realtimePCR仪（ABI7500,RotorGene3000），微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄

　　壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBRMix，引物及108copy/ul标准品

　　四、实验步骤

　　一、标准样品稀释：

取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106,105,104，向每

　　管加入90μlddH2O，取10μl108copy/ul的标样加入到107管中，充分混匀

　　后，从管中取10μl107copy/ul的液体到106管中。

按上述操作依次稀释，取得

　　5个倍数的标准样品。

注意，每次稀释都要换Tip头。

　　二、配制预混液：

取119μlddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μlRox

　　到装有175μlSYBRMix液的1.5ml离心管中，混匀。

　　3、分装预混液：

取7个小离心管，别离标记10八、107、10六、10五、104、UNK

　　（未知样）、NTC（阴性对照）。

向其中别离加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5

　　号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。

　　4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。

别离取上述样品20μl至第1-7

　　管中（第8管空出），每一个样品两个重复，共14个样品。

将加好样的8联管振荡。

　　五、设置分析仪参数如下：

95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次

　　数40，融解曲线温度范围60~95℃。

振荡好的样品进机进行PCR扩增。

　　六、扩增后利用软件分析CT值及未知样的定量结果。

　　五、实验结果与讨论

　　一、实验结果如何？

试分析。

　　答：

实验结果及分析如下。

（1）、实验具体数据见下表

　　Quantity

　　WellTaskCтCтMeanCтSDQuantityMeanQuantitySDCtThresholdA1STANDARD8.24888.25270.0055100000000

　　A2STANDARD8.25658.25270.0055100000000

　　B1STANDARD11.389311.65980.382510000000

　　B2STANDARD11.930311.65980.382510000000

　　C1STANDARD15.329214.96680.5126

1000000

　　C2STANDARD14.604314.96680.51261000000

　　D1STANDARD19.491219.30800.2590100000

　　D2STANDARD19.124919.30800.2590100000

　　E1STANDARD22.538522.41960.168110000

　　E2STANDARD22.300722.41960.168110000

　　F1UNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.625

　　F2UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.625

　　G1NTC32.5329

　　G2NTC32.9549

　　其中，A-E为标准样品，F为位置样品，G为阴性对照。

每一个样品做两个平行。

　　通过软件分析，由标准曲线取得的未知样品的定量结果约为5.83×107。

（2）、扩增曲线

　　从扩增曲线中能够看出，样品均经历了良好的扩增进程。

0.07120.07120.07120.07120.07120.0712

0.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.0712

　　（3）、标准曲线

　　从标准曲线中能够看出，R2值较好，标准曲线能够利用。

但扩增效率一样。

其中106和107的两个平行样的CT误差较大，这一现象能够从

（1）表中看出，其SD别离为0.5126和0.3825，相较其他点较大，一样以为SD大于0.5不睬想。

　　（4）、融解曲线

　　图中，能够看出每条曲线均为单峰且在一个合理的温度范围内（82~86℃），因此扩增是正常的，不存在非特异性扩增。

　　二、实验进程中需要注意些什么细节？

　　答：

（1）、操作进程中尽可能不要说话，以幸免污染；

（2）、用微量移液器加样品时应保证枪头深切液面以下，如此样品可不能留在管壁上；

　　（3）、不能在定量PCR管做标记，裸手不能够接触定量PCR管，操作时应戴手套。

　　（4）、8联定量PCR管加