《分子生物学检验技术》实验指导.docx
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《分子生物学检验技术》实验指导
《分子生物学检验技术》实验指导
【实验目的】
把握动物组织DNA提取的方法；
把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。
【实验原理】
获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。
因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。
较理想的DNA样品应达到以下三点要求：
①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。
DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。
本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。
而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。
【实验器材和试剂】
1、动物
小白鼠
2、设备
移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。
3、试剂
（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：
包括BufferCL、BufferPP、BufferGE、RNaseA、ProteinaseK
（7）生理盐水，4℃贮存
（8）无水乙醇、70%乙醇
【操作步骤】
1、制备肝匀浆
迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300μlBufferCL。
将肝匀浆液放入EP管，加入1.5μl蛋白酶K，漩涡震荡10s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。
2、提取DNA
（1）加入1.5μlRNaseA，颠倒混匀，37℃孵育15-60min。
（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。
（3）加入1/3体积的BufferPP，涡旋震荡20s，12000rpm离心3min。
（4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。
12000rpm离心1min，弃上清。
（5）加入300μl70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。
12000rpm离心1min，弃上清，室温干燥15min。
（6）加入50μlBufferGE溶解DNA（如果DNA的量比较大，能够65℃孵育以促进DNA的溶解），室温储存待测。
3、DNA浓度和纯度的测定
取0.1mlDNA样品，加蒸馏水至1ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。
运算：
DNA浓度（μg/ml）=A260×50×10（请咨询系数50、10是如何得来的？
）
DNA纯度=A260nm/A280nm
【注意事项】
（1）由于DNA要紧存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破裂要严格操纵好。
即要尽可能的将细胞膜破裂，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。
为幸免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。
在提取过程中，染色体会发生气械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温顺的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。
（2）用氯仿除去组织蛋白，要持续振荡使蛋白质变性。
如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。
（3）酚和氯仿均有专门强的腐蚀性，操作时应幸免接触皮肤。
（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会阻碍内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。
（5）提取过程应尽量保持低温。
（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。
据此来运算核酸样品的浓度。
紫外分光光度法只用于测定浓度>0.25μg/ml的核酸溶液。
（7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值>2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值<1.8表明样品中有蛋白质污染。
应按照后续实验要求，采取不同的方法纯化。
因此也会显现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情形，因此有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。
【结果】
1、A260=，A280=。
2、小鼠肝组织中DNA浓度是μg/ml。
3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是。
【摸索题】
提取和纯化的真核组织DNA有何用途？
你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？
有何意义？
请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？
实验二聚合酶链反应
【实验目的】
采纳聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因
【实验原理】
聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）用于体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。
其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。
反应中使用两条化学合成的寡核苷酸作为引物，分不与模板DNA两条单链互补，待扩增序列片段位于两条引物之咨询。
PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。
反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸（dNTP）等的参与。
反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度（Tm）以下，使引物能与靶序列形成杂交双链（退火）。
当温度升至72℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5‘向3’方向持续延伸，直至形成新的DNA双链。
通过变性、退火和延伸的一个循环能够使靶序列的分子拷贝数增加一倍。
由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，一个分子的模板通过n个循环可得2n个分子拷贝产物。
本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。
扩增所用的上游引物序列为：
5’-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：
5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。
【实验器材和试剂】
1、设备
PCR仪、0.2mlPCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。
2、试剂（20μl体系）
PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）
【操作步骤】
分不在PCR反应管中加入2×PCRmix10μl、上游和下游引物各2μl、DNA2μl和H2O4μl。
把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。
本实验的扩增程序为：
94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min。
重复35个循环后，于72℃再延伸10min，最后4℃保温。
反应终止后，将PCR反应管于12000rpm离心15s，取扩增产物进行电泳分析。
【注意事项】
1、由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。
因此，必须采取相应措施幸免发生污染。
2、PCR实验应当设置阴性对比反应，即在反应体系中不加模板DNA。
3、多份样品同时扩增时，可配制总的反应混合液，并分装于PCR管中，然后再在各管中分不加入模板。
4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。
PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。
5、PCR试剂与模板DNA及样品应分不储存于不同功能区的冰箱中。
6、操作时应戴手套，配制反应体系和加模板时应分不使用专用的移液器，所有耗材使用前必须经高压灭菌，用后按规定处理并丢弃在指定容器中。
【结果】
【摸索题】
PCR各组分在反应中的作用是什么？
降低退火温度、延长变性时刻会对反应有何阻碍？
实验三琼脂糖凝胶电泳
【实验目的】
把握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。
【实验原理】
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多，应用专门广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用技术。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也能够分离相对分子质量相同，及构型不同的DNA分子。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，一般琼脂糖凝胶分离DNA的范畴为0.2-20kb，其辨论率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范畴广。
荧光染料溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中形成复合物，紫外光照耀下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量。
由于EB是致癌剂，现在开发出了安全的染料，如SyberGreen、GelRed、GoldView等。
【仪器与试剂】
1.仪器
天平、锥形瓶、微波炉（或电炉）、制胶板、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析仪（或紫外线透射仪）、微量可调移液器、移液管、量筒、一次性塑料手套。
2.试剂
（1）50×TAE电泳缓冲液：
Tris碱242.0g、冰乙酸57.1ml、EDTA63.5g、NaOH10.0g，加蒸馏水至1000ml，使用前用蒸馏水稀释至1×TAE电泳缓冲液。
（2）6×loadingbuffer：
（0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液）或（0.25％溴酚蓝，40％（w/v）蔗糖水溶液），贮存于4℃。
（3）电泳级琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（母液:
将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可）、DNAMarker、DNA、蒸馏水。
【实验步骤】
1．配制1.5％的琼脂糖凝胶：
精确称取1.5g电泳级琼脂糖，加入100ml1×TAE电泳缓冲液，在微波炉里（或电炉）加热使琼脂糖颗粒完全溶解（加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发），待胶冷却至55ºC左右时，加入20µl溴化乙锭（也可先不加EB，而是电泳后再用0.5µg/ml的EB溶液浸泡染色），轻轻旋转混匀。
插入合适的梳子，将溶液倒入制胶板中，待凝聚后拔去梳子待用。
2.加样：
将凝胶置于电泳槽，加入1×TAE电泳缓冲液覆盖胶面即可。
各取PCR产物和DNA分子量参照物10µlDNA加入1µl6×loadingbuffer，混合后上样，分不加入琼脂糖凝胶孔内。
加样时切勿破坏点样孔周围的凝胶。
3.电泳：
合上电泳槽盖，打开电泳仪，操纵电压保持在60-80V，电流在40mA以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
4.染色：
未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。
5.观看和拍照：
电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于凝胶成像分析仪上观看电泳结果，并照相记录。
或在波长为254nm的紫外灯下观看DNA的荧光条带。
紫光灯下观看时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损害眼睛。
【注意事项】
1．阻碍DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
（1）DNA大小：
迁移速率与logN成反比（N为碱基对数目）。
分子越大，迁移越慢。
分子量相同的空间结构越紧密的电泳越快，如超螺旋>线性DNA。
（2）琼脂糖凝胶浓度：
不同的凝胶浓度，辨论不同范畴的DNA：
琼脂糖凝胶浓度
可辨论的线性DNA片段大小（kb）
0.5%
5－60
0.7%
0.8－12
1.0%
0.4－6
1.5%
0.2－4
1.75%
0.2－3
2.0％
0.1－3
（3）DNA构象：
一样迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
当条件变化时，情形会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。
（4）所加电压：
低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
使辨论成效好，凝胶上所加电压不应超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃。
（5）嵌入染料的存在：
降低线性DNA迁移率（不提倡加在电泳液中）。
（6）电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度阻碍DNA的迁移率。
无离子存在时，核酸差不多不泳动；离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性。
一样采纳1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）。
2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染，凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
3．电泳指示剂：
核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
【实验结果与分析】
1．电泳过程中，你自己或本组所采纳的电压为________伏特（v），电流为_______毫安（mA），通电时刻为_______分钟。
2．在实验报告上描画自己或实验组的电泳图谱，标明阳极和阴极位置。
【摸索题】
你的电泳结果如何？
成功或失败有哪些方面的缘故？
进行琼脂糖凝胶电泳时应注意哪些咨询题？
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