微生物学教案 第八章 微生物遗传.docx
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微生物学教案第八章微生物遗传
第八章——微生物遗传
第一节遗传的物质基础
遗传的物质基础是蛋白质还是核酸，曾是生物学中激烈争论的重大问题之一。
1944年Avery等人以微生物为研究对象进行的实验，无可辨驳地证实遗传的物质基础不是蛋白质而是核酸，并且随着对DNA特性（结构的多样性，自体复制特性等）的了解，“核酸是遗传物质的基础”这一生物学中的重大理论才真正得以突破。
下面分别介绍以DNA和RNA为遗传物质基础的微生物学实验证据。
一DNA作为遗传物质
1.Griffith的转化实验
1928年英国的一位细菌学家F.Griffith将能使小鼠致死的SⅢ型菌株加热杀死，并注入小鼠体内后，小鼠不死，而且也不能从小鼠体内重新分离到肺炎球菌。
但是当他们进一步将加热杀死，已无致病性的SⅢ菌和小量活的非致病的R型菌（由SⅡ型突变而来）一起注入小鼠体内后，意外地发现小鼠死了，而且从死的小鼠中分离到活的SⅢ型菌株（注意不是SⅡ型）。
显然，小鼠致死的原因正是由于这些SⅢ型菌的毒性作用，那么这些SⅢ菌从何而来呢?
实验不难证明注入小鼠体内的SⅢ菌已全部被杀死，因此不可能是SⅢ的残留者，同时，也不可能是R型回复突变所致，因为来自SⅡ型的R型的回复突变应为SⅡ型而不是SⅢ型。
唯一合理的解释是：
活的、非致病性的R型从已被杀死的SⅢ型中获得了遗传物质，使其产生荚膜成为致病性的SⅢ型。
Griffith将这种现象称为转化（transformation）。
几年后，这一现象在离体条件下进一步得到证实，并将引起转化的遗传物质称为转化因子（transformingfactor）。
Griffith是第一个发现转化现象的，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工作为后来Avery等人进一步揭示转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定了重要基础。
2.DNA作为遗传物质的第一个实验证据
Avery和他的合作者C.M.Macleod和M.J.McCarty为了弄清楚Griffith实验中的转化因子的实质，他们分别用降解DNA、RNA或蛋白质的酶作用于有毒的S型细胞抽提物，选择性地破坏这些细胞成份，然后分别与无毒的R型细胞混合，观察转化现象的发生。
结果发现，只有DNA被酶解而遭到破坏的抽提物无转化作用，说明DNA是转化所必须的转化因子，并在1944年发表了他们的实验结果，为Griffith的转化因子是DNA而不是蛋白质提供了第一证据。
为了消除“蛋白质论”者的怀疑，Avery等人将DNA抽提出来，进行不断的纯化，直到1949年，作为转化因子的DNA已纯化到所含蛋白质只有0.02%，这时的转化效果非但不减少反而增加，并随DNA浓度的增加而增加。
DNA作为遗传信息的载体已充分获得证实。
3.T2噬菌体的感染实验
1952年，AlfredD.Hershey和MarthaChase为了证实T2噬菌体的DNA是遗传物质，他们用P32标记病毒的DNA，用S35标记病毒的蛋白质外壳。
然后将这两种不同标记的病毒分别与其宿主大肠杆菌混合。
结果发现，用含有S35蛋白质的T2噬菌体感染大肠杆菌时，大多数放射活性留在宿主细胞的外边，而用含有P32DNA的T2噬菌体与宿主细菌混合时，则发现P32DNA注入宿主细胞，并产生噬菌体后代，这些T2噬菌体后代的蛋白质外壳的组成、形状大小等特性均与留在细胞外的蛋白质外壳一模一样，说明决定蛋白质外壳的遗传信息是在DNA上，DNA携带有T2的全部遗传信息（图8-1）。
图8-1T2噬菌体的实验
二、RNA作为遗传物质
有些生物只由RNA和蛋白质组成，例如某些动物和植物病毒以及某些噬菌体（见第七章）。
1956年，H.FraenkelConrat用含RNA的烟草花叶病毒（TobaccoMosaicVirus，简称TMV）所进行的拆分与重建实验证明RNA也是遗传物质的基础。
图8-2显示其实验的过程：
（1）用表面活性剂处理标准TMV，得到它的蛋白质；
（2）从TMV的变种HR（外壳蛋白的氨基酸组成与标准株存在2-3个氨基酸的差别）通过弱碱处理得到它的RNA；
（3）通过重建获得杂种病毒；
（4）标准TMV抗血清使杂种病毒失活，HR抗血清不使它失活，证实杂种病毒的蛋白质外壳是来自TMV标准株。
（5）杂种病毒感染烟草产生HR所特有的病斑，说明杂种病毒的感染特性是由HR的RNA所决定，而不是二者的融合特征；
（6）从病斑中一再分离得到的子病毒的蛋白质外壳是HR蛋白质，而不是标准株的蛋白质外壳。
以上实验结果说明杂种病毒的感染特征和蛋白质的特性是由它的RNA所决定，而不是由蛋白质所决定，遗传物质是RNA。
图8-2TMV病毒拆分重建实验
三、朊病毒的发现和思考
无论是DNA还是RNA作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。
但朊病毒（prion）的发现对“蛋白质不是遗传物质”的定论也带来一些疑云。
prpsc（见第七章）是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现该蛋白内有核酸。
但已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸（DNA或RNA）组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。
那么这是生命界的又一特例呢?
还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢?
（如有人坚持认为prpsc中可能含有极微量的核酸）还有待生命科学家去认识和探索。
但prpsc的致病性是由于prpc改变折叠状态所致，这一广为证实的事实，已是当今分子生物学研究的热点之一——由蛋白质的折叠与生物功能之间的关系的研究延伸至与疾病的致病因子之间的关系的研究，为治疗和根除prpsc引起的疾病（有人称为构象病）开辟新的途径。
“第二遗传密码”——“折叠密码”?
1958年，DNA双螺旋结构模型的奠基人之一，英国科学家Crick以DNA→RNA→蛋白质（或多肽链）的单向传递形式，首次提出遗传信息传递的中心法则。
三联密码将使RNA（mRNA）中的核苷酸序列转变成新生肽链中的氨基酸序列。
现已知道，新生肽链必须经过一系列极其复杂的加工和成熟过程，形成特定空间结构后才能成为有活性的蛋白质，这个过程包括氨基酸残基的化学修饰和正确、适时的折叠。
60年代，Anfinsen曾提出蛋白质的氨基酸序列已经包含了它的三维结构的全部信息，或一级结构决定高级结构，但是一级结构到底如何决定高级结构的呢?
如果说三联密码，即三个碱基决定一个氨基酸是“遗传密码”，那么多肽链中氨基酸序列如何决定蛋白质的空间结构是否也存在另一套密码——“折叠密码”呢?
“折叠密码”的翻译过程又是怎样的呢?
中心法则是否应表述为：
DNA→RNA→多肽链→蛋白质呢?
这是现代分子生物学研究中尚未解决的核心问题之一。
第二节微生物的基因组结构
基因组（genome）是指存在于细胞或病毒中的所有基因。
细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体（hoploid）；真核微生物通常是有二套基因又称二倍体（diploid）。
基因组通常是指全部一套基因。
由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。
但无论是原核还是真核微生物，其基因组一般都比较小（表8-1），其中最小的大肠杆菌噬菌体MS2只有3000bp，含3个基因。
一般来说这些依赖于宿主生活的病毒基因组都很小。
近年来对微生物基因组序列的测定表明，能进行独立生活的最小基因组是一种生殖道枝原体，只含473个基因，通过与流感嗜血菌序列比较研究，提出了256个基因可能是维持细胞生命活动所必需的最低数量的假说。
微生物基因组随不同类型（真细菌、古生菌、真核微生物）表现出多样性，下面分别以大肠杆菌、詹氏甲烷球菌和啤酒酵母为代表说明。
表8-1微生物与几种代表生物的基因组
生物
基因数
基组大小（bp）
MS2噬菌体（MS2Phage）
3
3×103
λ噬菌体（λPhage）
50
5×104
T40噬菌体（T4Phage）
150
2×105
生殖道枝原体（Mycoplasmagenitalium）
473
0.58×106
詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）*
1682
1.66×106
幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）
1.66×106
嗜热碱甲烷杆菌（Methanobacteriumthermoautotrophicum）
1.25×106
流感嗜血菌（Hacmophilusinfluenzae）
1760
1.83×106
闪烁古生球菌（Archaeoglobusfulgidus）
2.18×106
枯草杆菌（Bacillussubtilis）
3700
4.2×106
大肠杆菌（Escherichiacoli）
4100
4.7×106
黄色粘球菌（Myxococcusxanthus）
8000
9.4×106
啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）
5800
13.5×106
脉孢菌属（Neurospora）
＞5000
60×106
果蝇（Drosophilamelanogaster）
12000
165×106
Musmusculus（一种脊索动物）
70000
3300×106
Nicotianatobacum（一种烟草）
43000
4500×106
拟南芥菜（Arabidopsisthaliana）
16000～33000
70-145×106
人（human）
～50000-100000
30×109
*表示古生菌
一、大肠杆菌的基因组
大肠杆菌基因组为双链环状的DNA分子*，在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核（nucliod），其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的（scaffold）致密结构（大肠杆菌DNA分子长度是其菌体长度的1000倍，所以必须以一定的形式压缩进细胞中）。
大肠杆菌及其它原核细胞就是以这种拟核形式在细胞中执行着诸如复制、重组、转录、翻译以及复杂的调节过程。
基因组全序列测定于1997年由Wisconsin大学的Blattner等人完成，其基因组结构特点如下：
1.遗传信息的连续性
从表8-1可以看出，大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数（通常以1000bp～1500bp为一个基因计，说明这些微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。
除在个别细菌（鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌）和古生菌的rRNA和tRNA中发现有内含子或间插序列外，其它绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。
2.功能相关的结构基因组成操纵子结构
大肠杆菌总共有2584个操纵子，基因组测序推测出2192个操纵子。
其中73%只含一个基因，16.6%含有2个基因，4.6%含有3个基因，6%含有4个或4个以上的基因。
大肠杆菌有如此多的操纵子结构，可能与原核基因表达多采用转录调控有关，因为组成操纵子有其方便的一面。
此外有些功能相关的RNA基因也串联在一起，如构成核糖核蛋白体的三种RNA基因转录在同一个转录产物中，它们依次是16SrRNA23SrRNA5SrRNA。
这三种RNA除了组建核糖体外，别无他用，而在核糖体中的比例又是1∶1∶1，倘若它们不在同一个转录产物中，则或者造成这三种RNA比例失调，影响细胞功能；或者造成浪费；或者需要一个极其复杂、耗费巨大的调节机构来保持正常的1∶1∶1。
3.结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝
在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的，大肠杆菌有7个rRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方向表达。
7个rrn操纵子中就有6个分布在大肠杆菌DNA的双向复制起点oric（83分钟处）附近，而不是在复制终点（33分钟）附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的基因的表达量几乎相当于处于复制终点的同样基因的两倍，有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。
大肠杆菌及其它原核生物（如枯草杆菌的rrn有10个拷贝）rrn多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基因组经济而有效的结构。
4.基因组的重复序列少而短
原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比较短，一般为4～40个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次**。
*典型的原核生物染色体是环状DNA分子，但发现布氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）的染色体是线状的。
**流感嗜血菌基因组上有1465个“摄取位点”的重复，其重复序列为5′-AAGTGCGGTCA-3′。
二、啤酒酵母的基因组
啤酒酵母是单细胞真核生物，1996年，由欧洲、美国、加拿大和日本共96个实验室的633位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作，这是第一个完成测序的真核生物基因组。
该基因大小为13.5×106bp，分布在16个不连续的染色体中（表8-2）。
象所有其它的真核细胞一样，酵母菌的DNA也是与四种主要的组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）结合构成染色质（chromatin）的14bp核小体核心DNA；染色体DNA上有着丝粒（centromere）和端粒（telomere），没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列。
酵母菌基因组最显著的特点是高度重复，从表8-2可看出tRNA基因在每个染色体上至少是4个，多则30多个，总共约有250个拷贝（大肠杆菌约60个拷贝）。
rRNA基因只位于ⅩⅠⅠ号染色体的近端粒处，每个长9137bp，有100～200个拷贝。
酵母基因组全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的DNA重复序列，并称之为遗传丰余（geneticredundancy）。
酵母基因组的高度重复或遗传丰余是一种浪费和多余呢?
还是一种进化的策略呢?
显然应该是后者，所有现存的生物在自然的不断选择下，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。
也许是在份数这么多的丰余基因中，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响生命的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到有备无患。
因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒“进步”且“富有”，而细菌和病毒（许多病毒基因组上的基因是重叠的）似乎更“聪明”，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。
表8-2啤酒酵母的染色体
染色体
长度（kbp）
基因数
tRNA基因数
Ⅰ
230
106
4
Ⅱ
813
423
13
Ⅲ
315
172
10
Ⅳ
1532
814
27
Ⅴ
577
292
13
Ⅵ
270
136
10
Ⅶ
1091
573
33
Ⅷ
563
291
11
Ⅸ
439
231
10
Ⅹ
745
387
24
Ⅺ
666
334
16
ⅩⅠⅠ
1078
550
22
ⅩⅠⅠⅠ
924
487
21
ⅩⅠⅤ
784
421
15
ⅩⅤ
1092
571
20
ⅩⅤⅠ
948
499
17
注：
ⅩⅠⅠ号染色体长度只包括了二个拷贝rDNA，实际上有100-200个，长1-2×106bp。
三、詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）的基因组
詹氏甲烷球菌属于古生菌，该菌发现于1982年。
生活在2600m深，260个大气压，94℃的海底火山口附近。
1996年由美国基因组研究所（TheInstituteforGenomicResearch，简称TIGR）和其它5个单位共40人联合完成了该菌的基因组全测序工作。
这是完成的第一个古生菌和自养型生物的基因组序列。
根据对该菌全基因组序列分析结果完全证实了1977年由Woese等人提出的三界学说。
因此有人称之为“里程碑”的研究成果。
从目前已知的詹氏甲烷球菌和其它古生菌的基因组全序列分析结果来看，几乎有一半的基因通过同源搜索在现有的基因数据库中找不到同源序列。
例如詹氏甲烷球菌只有40%左右的基因与其它二界生物有同源性，其中有的类似于真细菌，有的则类似于真核生物，有的就是二者融合。
可以说古生菌是真细菌和真核生物特征的一种奇异的结合体。
一般而言，古生菌的基因组在结构上类似于细菌。
例如：
詹氏甲烷球菌有一个大小为1.66×106bp的环形染色体DNA，具有1682个编码蛋白质ORF；功能相关的基因组成操纵子结构，共转录成一个多顺反子转录子；有2个rRNA操纵子；有37个tRNA基因，基本上无内含子；无核膜等。
但是负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物，特别是古生菌的转录起始系统基本上与真核生物一样，而与细菌的截然不同。
古生菌的RNA聚合酶在亚基组成和亚基序列上类同于真核生物的RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，而不同于真细菌的RNA聚合酶。
与之相应的是启动子结构也类同于真核生物，TATAbox序列都位于转录起始点上游25-30核苷酸处，这与细菌启动子的典型结构（-10和-35）相悖。
古生菌的翻译延伸因子EF-Ia（细菌中是EF-Tu）和EF-2（细菌中是EF-G），氨酰tRNA合成酶基因，复制起始因子等均与真核生物相似。
此外，古生菌还有5个组蛋白基因，其产物组蛋白的存在可能暗示：
虽然甲烷球菌基因图谱看上去酷似细菌，但基因组本身在细胞内可能实际上是按典型的真核生物样式组织成真正的染色体结构。
同时具有细菌和真核生物基因组结构特征的古生菌对研究生命的起源和进化无疑是十分重要的，而许多古生菌特有的基因（目前还未搜索到与其它二界生物同源的基因）也正吸引着越来越多的科学家去研究和探索，这些特有的基因也许为许多新奇的蛋白质编码，这将为开发新的药物，生物活性物质或在工业中实施新的技术开拓广阔的前景。
微生物向邻居“借”或“盗用”基因*
微生物通过接合、转导和转化进行的水平方向的基因转移是早已知道的事实。
但近年来的研究表明，微生物似乎还善长向邻居“借”或“盗用”（appropriate）基因。
这些邻居包括它们的“同类”——微生物，也包括它们的“异类”——高等动植物。
基因组序列分析表明，生活在意大利海底火山口附近的激烈热球菌（Pyrococcusfuriosus）含有来自近邻但亲缘关系较远的Thermococcuslitotralis的转运麦芽糖的基因，序列分析表明二者仅有138bp的差异，而生活在太平洋的同种激烈热球菌却没有这种基因。
激烈热球菌的转运麦芽糖基因看来是向T.litoaralis“借来”的，是否会“还”回去，目前难以得知。
此外，微生物还有向高等动、植物“盗用”（appropriate）基因的本领。
例如，耐放射异常球菌（Deinococcusradiodurans）含有几个只有在植物中才有的基因；结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）的基因组上至少含有8个来自人的基因，而且这些基因编码的蛋白质能帮助细菌逃避宿主的防御系统，显然，这是结核分枝杆菌通过某种方式从宿主那儿“盗用”了这些基因为自己的生存服务。
有关“借”或“盗用”的机制目前还不很清楚，但转座因子的普遍存在及其转座功能可能起了很大的作用。
*PenisiE.1999,Science,5418:
1305~1306
三、詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）的基因组
詹氏甲烷球菌属于古生菌，该菌发现于1982年。
生活在2600m深，260个大气压，94℃的海底火山口附近。
1996年由美国基因组研究所（TheInstituteforGenomicResearch，简称TIGR）和其它5个单位共40人联合完成了该菌的基因组全测序工作。
这是完成的第一个古生菌和自养型生物的基因组序列。
根据对该菌全基因组序列分析结果完全证实了1977年由Woese等人提出的三界学说。
因此有人称之为“里程碑”的研究成果。
从目前已知的詹氏甲烷球菌和其它古生菌的基因组全序列分析结果来看，几乎有一半的基因通过同源搜索在现有的基因数据库中找不到同源序列。
例如詹氏甲烷球菌只有40%左右的基因与其它二界生物有同源性，其中有的类似于真细菌，有的则类似于真核生物，有的就是二者融合。
可以说古生菌是真细菌和真核生物特征的一种奇异的结合体。
一般而言，古生菌的基因组在结构上类似于细菌。
例如：
詹氏甲烷球菌有一个大小为1.66×106bp的环形染色体DNA，具有1682个编码蛋白质ORF；功能相关的基因组成操纵子结构，共转录成一个多顺反子转录子；有2个rRNA操纵子；有37个tRNA基因，基本上无内含子；无核膜等。
但是负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物，特别是古生菌的转录起始系统基本上与真核生物一样，而与细菌的截然不同。
古生菌的RNA聚合酶在亚基组成和亚基序列上类同于真核生物的RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，而不同于真细菌的RNA聚合酶。
与之相应的是启动子结构也类同于真核生物，TATAbox序列都位于转录起始点上游25-30核苷酸处，这与细菌启动子的典型结构（-10和-35）相悖。
古生菌的翻译延伸因子EF-Ia（细菌中是EF-Tu）和EF-2（细菌中是EFG），氨酰tRNA合成酶基因，复制起始因子等均与真核生物相似。
此外，古生菌还有5个组蛋白基因，其产物组蛋白的存在可能暗示：
虽然甲烷球菌基因图谱看上去酷似细菌，但基-因组本身在细胞内可能实际上是按典型的真核生物样式组织成真正的染色体结构。
同时具有细菌和真核生物基因组结构特征的古生菌对研究生命的起源和进化无疑是十分重要的，而许多古生菌特有的基因（目前还未搜索到与其它二界生物同源的基因）也正吸引着越来越多的科学家去研究和探索，这些特有的基因也许为许多新奇的蛋白质编码，这将为开发新的药物，生物活性物质或在工业中实施新的技术开拓广阔的前景。
第三节质粒和转座因子
质粒（plasmid）和转座因子（transposableelement）都是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子。
前者是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中；后者是位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。
目前对细菌中的质粒和转座因子已研究得比较详细，本节将以细菌为例介绍这两种遗传因子。
一、质粒的分子结构
质粒通常以共价闭合环状（covalentlyclosedcircle，简称CCC）的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中（图8-3），但从细胞中分离的质粒大多是三种构型，即CCC型、OC型（opencircularform）和L型（linearform）（图8-4）。
近年来在疏螺旋体、链霉菌和酵母菌中也发现了线型双链DNA质粒和RNA质粒。
质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb。
图8-3电子显微镜下观察到的完整的细菌染色体和质粒（箭头所指处为质粒）
图8-4质粒的三种构型
根据质粒的分子大小和结构特征，通过超离心或琼脂糖凝胶电泳可将质粒与染色体DNA分开，从而分离得到质粒。
这是因为虽然染色体DNA也是以超螺旋结构存在于细胞中，但其分子大小远远超过质粒（例如：
大肠杆菌染色体是4100kb，而ColE1质粒只有9kb），因此在分离过程中染色体DNA总是会断裂成线状，其两端可以自由转动而使分子内的紧张态
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