牡丹种子中分离的两种新型茋类物质顺式和反式suffruticosol D的体外抗肿瘤作用翻译.docx

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牡丹种子中分离的两种新型茋类物质顺式和反式suffruticosolD的体外抗肿瘤作用翻译

InternationalJournalofOncology,2015,IF=3.018

Invitroantitumoreffectsoftwonoveloligostilbenes,cis-andtrans-suffruticosolD,isolatedfromPaeoniasuffruticosaseeds

从牡丹种子中分离的两种新型茋类物质:

顺式和反式suffruticosolD的体外抗肿瘤作用

NadinMarwanAlmosnid,YingGao,ChunnianHe,HyoSimParkandElliotAltman

摘要：

天然衍生的茋类成分已被证明具有细胞毒性，有抗类固醇、抗诱变、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的生物活性。

之前的植物化学研究表明牡丹的种子富含天然茋。

本研究证明了从牡丹种子中分离的茋类成分：

顺式和反式suffruticosolD的抗肿瘤作用，并检验了作用机制。

顺式和反式suffruticosolD表现出对人类肿瘤细胞系A549（肺）、BT20（乳腺）、MCF-7（乳腺）和U2OS（骨肉瘤）显著的细胞毒性，但对正常人类细胞系HMEC（乳腺）和HPL1A（肺）表现出显著较低的毒性。

我们还发现，顺式和反式suffruticosolD通过激发氧化应激，促进细胞凋亡，降低线粒体膜电位，抑制细胞运动性，并且阻断人肺癌细胞中的NF-κB途径发挥其抗肿瘤作用。

此外，我们评估了各自的生物效力，发现反式suffruticosolD比顺式suffruticosolD更有效。

总的来说我们的结果表明顺式和反式suffruticosolD可能是对癌症更有希望的化疗剂。

引言

目前的癌症药物昂贵，且往往造成严重的副作用。

美国国家癌症研究所开始在20世纪60年代开始研究抗肿瘤植物提取物，前提是从治疗植物中获得的天然化合物可能产生抗癌药物，从此以后一直有很大的研究兴趣。

中药（TCMs）用晒干的植物或植物提取物为年的实验和临床研究提供了低成本的，成千上万的饮食和药物治疗已证明，中药中使用的超过400种植物对于各种癌症的预防或治疗是有效的抗癌药物（1-4）。

然而，为确定中药中单体化合物的有效性，仍有许多工作要做。

牡丹，是芍药属中一种广泛应用的药用植物。

本属包括大约35种，分为三组：

北美芍药组，芍药组，和牡丹组（5）。

中国药典已经记录了牡丹根（根皮）作为重要的中药来源（6）。

牡丹提取物具有细胞毒性、抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性（5）。

之前对牡丹的光化学研究确定了超过260种生物活性化合物，包括酚类、单萜酰葡萄糖苷、芍药醇、类黄酮、单宁、类固醇、三萜类化合物和茋类化合物（7）。

最近的一项研究表明，牡丹的种子含有与其他化合物相比的大量茋类物质（7,8）。

茋类物质是一类植物中广泛存在的1，2二苯基乙烯核多酚（9）。

由于其抗肿瘤、抗类固醇、抗诱变、抗氧化、抗疟疾和抗炎生物活性，茋类化合物引起了极大的兴趣（10-16）。

茋类物中一个熟知的例子是白藜芦醇，并且其抗肿瘤活性已被深入研究。

几个体内和体外研究表明，白藜芦醇抑制癌细胞的生长和与影响癌症发展有关的各种分子靶点，如Wnt信号通路，核因子κB（NF-κB）和MAPK/ERK通路在不同类型的癌症（17,18）。

首先，两个新的茋类物质顺式和反式suffruticosolD是从牡丹种子中提取的（5）。

这两种化学物质具有类似的结构，因为反式suffruticosolD的质量碎裂模式非常类似于顺式suffruticosolD，顺式suffruticosolD与反式suffruticosolD仅是烯烃氢信号不同（图1）。

本研究中，我们研究了顺式和反式suffruticosolD的抗肿瘤活性，并研究这两种化学物作用于体外癌细胞的机制。

一、材料和方法：

1.化合物分离：

牡丹的种子在中国安徽的铜陵收集，并确定在2012年9月一个凭证标本（2012001）已存入种子资源库在药用植物研究所，中国医学科学院和北京联合医学院。

如先前所描述的顺式和反式suffruticosolD的从牡丹干种子中萃取和分离（5）。

将化合物以10mM（mmol/L）的浓度回溶于二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州，圣路易斯）中并4℃下冷藏。

2.细胞培养：

包括A549（肺癌），BT20（雌激素受体阴性人乳腺癌），MCF-7（雌激素受体阳性人乳腺癌）和U2OS（人骨肉瘤）的四种人癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心（美国维吉尼亚州，马纳萨斯）。

稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的A549细胞系购自CellBioLabs公司（圣地亚哥，美国加利福尼亚州）。

A549、A549-GFP和BT20细胞在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich）中培养，MCF-7细胞在DMEM培养基（ATCC）中培养，U20S细胞在McCoy's5A培养基（ATCC）中培养。

作为对照，从名古屋大学获得HPL1A细胞（人外周肺上皮细胞），并在DMEM/F12培养基（Sigma-Aldrich）中培养;HMEC细胞（原代人乳腺乳腺上皮细胞）购自ATCC并在McCoy's5A培养基中培养。

从日本名古屋大学获得HPL1A细胞（原代人外周肺上皮细胞），在DMEM/F-12K培养基（Sigma-Aldrich）中培养。

所有培养基含有10％FBS（SigmaAldrich）和1％链霉素和青霉素（Sigma-Aldrich）。

将这些细胞在37℃、5％CO2的潮湿环境中培养。

3.细胞增殖测定：

使用刃天青还原试剂AlamarBlue（Invitrogen公司，美国马里兰州，弗雷德里克）评价化合物的细胞毒性。

将细胞以每孔5×103个细胞的密度接种在含有100μl培养基的96孔微量培养板中，预处理16小时。

接下来，用含有320、100、32、10、3.2、1.0和0.32μM七种不同浓度的顺式或反式suffruticosolD的培养基代替之前的培养基。

用1％DMSO作载体对照。

将细胞置于37℃的培养箱中48小时。

用含有仅用载体处理过的细胞的培养基作阴性对照。

随后，将AlamarBlue溶液加入到培养基中，并将细胞在CO2培养箱中恒温培育1小时。

使用酶标仪（MolecularDevices公司，美国加利福尼亚州，Sunnyvale）在Ex555nm和Em590nm处测量染料的荧光强度变化。

使用GraphPadPrism软件（GraphPadSoftware公司，美国加利福尼亚州，LaJolla）通过IC50测定抑制细胞生长50％的浓度来测定细胞毒性。

对于N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）衰减测定，用不同浓度的顺式或反式suffruticosolD处理细胞培养48小时后（可加10mMNAC（Sigma-Aldrich）），使用AlamarBlue测定法评估细胞存活力。

4.细胞凋亡检测：

根据制造商的说明书，使用FlowCellectAnnexinRed试剂盒（EMDMillipore公司，美国麻萨诸塞，Billerica）测定A549细胞中的凋亡率。

将A549细胞接种在96孔板中。

用100、32和10μM浓度的顺式或反式suffruticosolD处理24小时后，收集浮动和附着的细胞用于分析。

将细胞在700xg的离心力下离心7分钟，并回溶于100μl缓冲液（EMDMillipore）。

然后，细胞用膜联蛋白染色15分钟，用7-氨基-放线菌素D（7-AAD）染色5分钟，用GuavaEasyCyte流式细胞仪（EMDMillipore）检测。

用GuavaInCyte软件分析数据。

5.凋亡抗体阵列：

根据制造商的说明书，使用人细胞凋亡抗体阵列试剂盒（RayBiotech，Inc.，美国加利福尼亚，Norcross）评估凋亡蛋白表达。

将A549细胞以每孔8,000个细胞的强度接种在96孔板中，然后用50μM浓度的顺式或反式suffruticosolD处理6小时。

将细胞在含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中裂解。

使用蛋白质浓缩柱（EMDMillipore）将细胞裂解物浓缩至总蛋白质浓度为2mg/ml。

然后将样品用缓冲液稀释10倍，并在阵列膜上在室温下恒温培养2小时，并用洗涤缓冲液洗涤5次。

随后将与生物素结合的抗体混合物的混合物加入膜中并在4℃培养过夜。

然后将样品与HRP结合的链霉亲和素在室温下培养2小时，并使用化学发光底物检测信号。

使用ImageStudio软件（LI-CORBiotechnology，美国内布拉斯加州，Lincoln）定量每个阵列点的强度，然后归一化为内部对照。

6.氧化应激测定：

使用Hitkit氧化应激试剂盒（ThermoScientific，美国MA，Waltham）测定活性氧（ROS）的产生。

简言之，将A549细胞用顺式或反式suffruticosolD处理24小时，用温的37％甲醛固定，并用Hoechst和二氢乙锭（DHE）染料在37℃、5％CO2下染色30分钟。

将1μM浓度的阿霉素（DOX）用作阳性对照，将仅用媒介物处理的细胞用作阴性对照。

细胞核中的ROS（活性氧）生成通过产生溴化乙锭荧光来指示，并且通过使用ArrayScanVTIHighcontent筛选（HCS）读数器（ThermoScientific）测量核荧光强度来评估。

获取图像，并通过vHCS扫描软件分析数据。

7.细胞运动性测定：

以如下方法用蓝色荧光珠（LifeTechnologies，美国OR，Eugene）涂覆96孔胶原板（Corning，美国NY，Corning）。

将珠子以14000g离心1分钟，用PBS洗涤两次，然后将75μl珠子嵌入96孔胶原板的每个孔中，并在37℃下培养1小时。

在含有10％FBS的培养基中用不同浓度的顺式或反式suffruticosolD处理细胞18小时之后。

用PBS洗涤板5次，将A549-GFP细胞以500个细胞/孔接种在包被的板中，并在37℃温育1小时。

用无血清培养基处理的细胞用作阴性对照，用含有10％FBS的培养基处理的细胞用作阳性对照。

使用ArrayscanVTIHCS读数器（ThermoScientific）对细胞轨道成像，并且通过vHCS扫描软件分析数据。

计算测试化合物和对照的每个细胞的完整轨迹面积的平均值。

8.多参数细胞毒性试验：

使用HCS分析来测量核形态，细胞膜的通透性，以及线粒体膜电位变化，细胞毒性相关联的三个参数。

A549细胞以不同浓度的顺式或反式suffruticosolD24处理小时。

然后将细胞固定并用含有Hoechst染料，膜通透性染料和线粒体膜电位染料（ThermoScientific）的温热溶液染色。

使用ArrayscanVTIHCS读数器（ThermoScientific）对细胞成像。

收集核大小，细胞渗透性和线粒体膜电位的数据，并使用vHCS扫描软件进行分析。

9.蛋白质印迹分析：

A549细胞用50μM的顺式或反式suffruticosolD处理3小时，然后与10ng/ml的TNF-α培育30分钟。

将用NF-κB抑制剂Bay11-7082（10μM）（Sigma-Aldrich）处理的细胞用作阳性对照，将仅用媒介物处理的细胞用作阴性对照。

处理后，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich）的M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂（ThermoScientific）裂解细胞，并在4℃下以13,000rpm离心5分钟。

使用PierceBCA蛋白测定试剂盒（ThermoScientific）测定蛋白质浓度。

在4-20％Tris-甘氨酸凝胶（ThermoScientific）上分离蛋白质，并电泳转移至PVDF膜。

以下使用的主要抗体：

phosphorylated-NF-κBp65、NF-κBp65（CellSignalingTechnology公司，美国MA，Danver）和肌动蛋白（SantaCruzBiotechnology公司，美国德克萨斯州，Dallas）。

在4℃下将膜与初级抗体以1：

1000的浓度培养过夜。

用1XPBS洗涤5次后，将膜在室温下与HRP结合的anti-rabbitIgG二抗孵育2小时。

膜用化学发光底物（ThermoScientific）显影，并用chemiDocMP成像系统（Bio-Rad公司，美国加利福尼亚州，Hercules）扫描。

10.NF-κB核易位测定：

多重NF-κB活化HCS试剂盒（ThermoScientific）用于评估NF-κB核易位。

用不同浓度的顺式或反式suffruticosolDA549细胞预处理4小时，然后将10ng/ml的TNF-α（Sigma-Aldrich公司）加入到细胞处理30分钟。

处理后，在检测前将细胞固定并透化。

通过加入NF-κBp65初级抗体，然后用与DyLight549和Hoechst染料（ThermoScientific）偶联的第二抗体染色来检测NF-κB分布。

用仅含载体的培养基处理的细胞用作阴性对照，用25ng/mlTNF-α处理的细胞用作阳性对照。

使用ArrayscanVTIHCS读数器使细胞成像。

收集核和细胞质区域之间的NF-κB荧光强度平均差异的数据，并通过vHCS扫描软件进行分析。

二、结论

1.顺式和反式suffruticosolD在肺癌，乳腺癌，和骨癌细胞的细胞毒性

在48小时处理后，顺式和反式suffruticosolD对A549（肺），BT20（乳腺），MCF-7（乳腺）和U2OS（骨肉瘤）癌细胞系显示出显著的细胞毒性作用。

suffruticosolD对这些癌细胞的IC50值为9.93至46.79μM，如表I所示。

有趣的是，我们观察到反式suffruticosolD（9.93-15.84μM）比顺式suffruticosolD（13.42μM-46.79μM）的IC50值低。

此外，顺式和反式suffruticosolD对正常乳腺上皮细胞HMEC（IC50值分别为146.3和269.5μM）和正常肺上皮细胞HPL1A（IC50值分别为78.3和177.5μM）均显示出较弱的细胞毒性（表I）。

表1：

顺反式suffruticosolD处理的癌细胞和正常细胞系的IC50值

用不同浓度的顺式或反式suffruticosolD处理细胞48小时，并用AlamarBlue染料评价细胞的存活力。

数据为平均值±标准差，并且重复实验3次。

2.顺式和反式suffruticosolD诱导A549肺癌细胞凋亡

为了找出这些细胞凋亡是否是由于细胞毒性，我们使用用顺式或反式suffruticosolD处理的A549细胞进行凋亡测定。

在24小时处理后，与未处理的细胞相比，两种化合物在宽范围的浓度下显示出显著的凋亡诱导（*P<0.05，**P<0.01或***P<0.001），并且凋亡效应是浓度依赖性的（图2，A-D）。

反式suffruticosolD在10,32和100μM的浓度下分别诱导30.1、39.8和41.9％的A549细胞凋亡。

顺式suffruticosolD在10、32和100μM的浓度下分别诱导22.2、27.1和45.3％的A549细胞凋亡。

接着，我们用细胞凋亡蛋白质阵列来分析和确定顺式和反式suffruticosolD对细胞凋亡蛋白质的影响。

凋亡抑制蛋白家族（IAP）中的两种，X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）和存活蛋白以及热休克蛋白Hsp60和Hsp70，在用顺式和反式suffruticosolD处理后表现出显著的下降（图2，E）。

反之，死亡受体6（DR6），也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员21（TNFRSF21）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B（p27）和BH3interacting-domain死亡激动剂（BID），这些在顺式和反式suffruticosolD处理后均有上升（图2，F）。

图2.通过顺式和反式suffruticosolD诱导A549细胞凋亡。

在用顺式或反式suffruticosolD处理24小时后，用AnnexinV/7-AAD对A549细胞染色，并通过流式细胞术评估凋亡细胞的百分比。

仅用载体处理的细胞作阴性对照。

（A-C）用各种浓度的顺式或反式suffruticosolD处理的A549细胞的膜联蛋白V/7-AAD双染色。

（D）通过顺式或反式suffruticosolD诱导的凋亡细胞的百分比。

（E、F）顺式或反式suffruticosolD对凋亡的关键调节蛋白的影响。

误差线表示来自三次实验的标准偏差。

*P≤0.05;**P≤0.01;***P≤0.001。

3.顺式和反式suffruticosolD诱导A549肺癌细胞中ROS的产生

我们检查了A549细胞中的细胞ROS水平，以确定顺式和反式suffruticosolD是否诱导氧化应激。

如图3A所示，顺式和反式suffruticosolD都将非荧光DHE转化为与DNA结合的荧光乙锭，表明它们在A549细胞中诱导ROS产生。

定量数据显示两种化合物以浓度依赖性方式显着诱导ROS产生（**P<0.01，***P<0.001或****P<0.0001）。

处理24h后，反式suffruticosolD在10、32和100μM浓度下将ROS水平提升32.8、34.6和87.2％，而在A549细胞中浓度为10、32和100μM时，顺式suffruticosolD使ROS水平分别提升32.8、55.6和73.1％（图3，B）。

为进一步验证ROS水平是否与顺式和反式suffruticosolD诱导的细胞毒性相关联，我们用抗氧化剂的N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和不同浓度的顺式或反式suffruticosolD共同处理A549细胞48小时。

我们观察到，在所有测试的浓度下，10mM的NAC都减轻了在A549细胞中由顺式或反式suffruticosolD诱导的细胞死亡（图3，C）

图3.在顺式和反式suffruticosolD诱导的A549细胞中的氧化应激。

A549细胞用不同浓度的顺式或反式suffruticosolD处理24小时，然后用Hoechst和DHE染料染色。

用doxorubicin（阿霉素）处理的细胞用作阳性对照，用仅用载体处理的细胞作阴性对照。

通过转化为溴化乙锭的DHE的荧光强度测量ROS水平。

（A）HCS阅读器的荧光细胞图像。

比例尺，100μm。

（B）在用不同浓度的顺式或反式suffruticosolD的处理的A549细胞ROS水平（C）抗氧化NAC减少了由顺式或反式suffruticosolD导致的A549细胞的死亡。

误差线表示来自三个实验的标准偏差。

*P≤0.05;**P≤0.01;***P≤0.001。

4.顺式和反式suffruticosolD抑制A549肺癌细胞的运动性

为了测试顺式和反式suffruticosolD是否影响癌细胞运动性，我们测量治疗后迁移细胞产生的轨迹的大小，其与细胞运动的大小成比例。

如图4A所示，在含血清的培养基中用顺式或反式地曲唑D处理的A549细胞表现出较小的运动活性，由每个细胞的轨迹面积比未处理的细胞更小。

所有浓度顺式和反式suffruticosolD在A549细胞测试中都显著抑制细胞运动（***P<0.001或****P<0.0001）（图4，B）。

反式suffruticosolD在10、32和100μM的浓度下分别将A549细胞运动性降低了40.7、40.7和54.9％，而顺式suffruticosolD在10、32和100μM的浓度下分别将A549细胞运动性降低了42.3％、42.0和50.4％。

图4.在A549细胞中顺式和反式suffruticosolD诱导的细胞运动性变化。

将A549-GFP细胞接种在具有单层荧光珠的96孔板中。

在用顺式或反式suffruticosolD处理18小时后，通过测量荧光轨迹面积评价个体细胞运动。

用无血清培养基处理的细胞作为阴性对照，用含有10％血清的培养基处理的细胞作为阳性对照。

（A）显示细胞运动的荧光轨迹区。

比例尺，200μm。

（B）测量用不同浓度的顺式或反式suffruticosolD处理的细胞的细胞轨道区域。

误差线表示来自三个实验的标准偏差。

*P≤0.05;**P≤0.01;***P≤0.001。

5.顺式和反式suffruticosolD降低A549细胞中线粒体的膜电位

为了确定顺式和反式suffruticosolD在人肺癌细胞中的细胞毒性作用，我们使用HCS读数器测量了三种细胞健康参数，核形态、细胞膜通透性和线粒体膜电位变化。

如图5所示，在线粒体电位通道中，未处理的A549细胞显示出明亮的荧光强度，表明完整的线粒体膜。

相比之下，在用顺式或反式suffruticosolD处理的细胞中，染料的荧光强度在所有测试浓度下显着降低，这表明顺式和反式suffruticosolD处理的A549细胞中线粒体膜电位的显著降低（***P<0.001）。

我们还观察到高浓度（100μM）反式suffruticosolD处理的细胞的细胞核收缩、细胞膜通透性增加（*P<0.05或**P<0.01）。

然而，在用顺式suffruticosolD处理的细胞中，在核大小和细胞膜通透性方面没有检测到显着变化。

图5.顺式和反式suffruticosolD处理的A549细胞中的多参数细胞毒性。

A549细胞用不同浓度的顺式或反式suffruticosolD处理24小时，然后用三种染料同时染色（Hoechst染料，细胞渗透性染料和线粒体膜电位染料）。

用载体处理的细胞仅用作阴性对照，用10μM缬氨霉素处理的细胞用作阳性对照。

（A）通过HCS阅读器的荧光细胞图像。

比例尺，100μm。

（B-D）用顺式或反式suffruticosolD处理的细胞的核大小、细胞通透性和线粒体膜电位的评价。

误差线表示来自三次实验的标准偏差。

*P≤0.05;**P≤0.01;***P≤0.001。

6.顺式和反式suffruticosolD抑制TNF-α诱导的NF-κB活化：

我们通过免疫印迹分析来检验顺式和反式suffruticosolD对NF-κB在A549细胞中表达的影响。

如图6A所示，在TNF-α刺激后，检测到磷酸化NF-κBp65的过表达，并且过表达被顺式和反式suffruticosolD显著抑制。

在反式suffruticosolD-处理的细胞中，磷酸化NF-kB的p65的表达几乎被完全阻断，而在顺式suffruticosolD处理的细胞中，磷酸化的NF-κBp65的表达被阻断，与Bay11-7082抑制剂对照引起的阻断一样。

接下来，我们使用HCS分析来测试顺式或反式suffruticosolD是否能阻断A549细胞中的NF-κB核易位。

如图6B所示，NF-κB荧光染色保留在细胞质区域，在未处理细胞的核区域中没有检测到荧光，在用TNF-α处理的细胞中，在核区域中检测到NF-κB荧光染色，表明NF-κB从细胞质转移到细胞核。

在用顺式或反式suffruticosolD处理的A549细胞中，NF-κB荧光染色保留在细胞质中，这表明NF-κB向细胞核的易位被阻断。

在所有测试浓度反式suffruticosolD处理下都显著抑制NF-κB活化水平（***P<0.001）（图6C）。

相比之下，仅在使用100μM顺式suffruticosolD处理中显着抑制了NF-κB的活化（***P<0.001）。

图6.顺式和反式suffruticosolD抑