最全的G筛选稳定表达细胞系总结5Word下载.doc

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HEPES缓冲液配方如下：

90ml水中，0.8gNaCl,0.037gKCl,0.0135gNa2HPO4.2H2O,0.1g葡萄糖，0.5gHEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。

Goodanswer:

推荐用HEPES。

特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。

1mol/LHEPES的简单配置：

HEPES11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。

HEPES最终使用浓度15-20mM。

Q:

我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？

我做过G418杀伤曲线，300ug\ml就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行？

会不会有什么问题？

A:

G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,11.00ng/ml等１2个级别,培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。

我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。

我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。

我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？

在这期间可以换液吗？

筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418？

如果要加的话什么浓度比较合适？

应该保持这个浓度9天以上，每3天换液一次。

筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的G418，一般在最低致死浓度的60%左右。

在6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选，2周后单克隆形成，于是就挑取单克隆，之前6孔板里的细胞很多，用0.125%typsin+0.25%EDTA消化，1000转/分离心10分钟，肉眼可以看到细胞沉淀，接种至25ml塑料培养瓶中，镜下看密度可以，但是细胞形态成多态性：

少量是圆形，大多数是梭形。

第2天一看没有细胞贴壁！

做了2次都这样，请问我的操作步骤有问题吗？

看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在6孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡，少数细胞存活并逐渐生长，只能叫作克隆形成。

我们一般在转染后24h将细胞消化下来（0.25%trypsin+0.02%EDTA），以1：

10或更高的比例传代，贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。

待大部分细胞死亡，极少数细胞渐形成克隆。

再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作（具体操作方法见附件）。

从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行2-3次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。

另外，在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔，否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象，也可以在消化完用正常培养基，待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。

还有，在多克隆形成后一定要及时冻存，以备后续试验。

你挑选的克隆，不能贴壁原因可能有二;

一、细胞很少，那么你接种后，由于密度较低，细胞是接触生长，所以密度太低，细胞难以生存。

二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选，这样也会死亡。

消化后先用无G418的培养液培养，贴壁后，再换取G428培养液。

我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来，书上说用弯头吸管，我试了，不好用，根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来，我想着用刮勺，但进口的特别贵，所需又不多，你看有什么别的好办法吗？

谢谢了！

如何挑选克隆。

你可以按以下操作方法进行：

【操作方法】

（1）将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确；

（2）在超净台内，弃去培养皿内的培养液；

（3）用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20秒；

（有人可提前在一孔中装入0.02%EDTAPBS）

（4）将24孔培养板每孔加G418选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸块数次，以使黏附的细胞脱落下。

镜下观察确认细胞已经脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆方法转移同上；

（有人在细胞贴壁后再选用培养基）

（5）将移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37℃5%CO2培养箱培养，2-5天；

（6）待细胞长满后，0.25%Trypsin消化液消化，并将细胞转移至6孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。

用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了，已经在细胞瓶中扩大培养，但发现与正常HEp-2细胞相比，建系的细胞生长得很慢，细胞间的边界也不是很清楚，而且细胞长得不均匀，这样正常吗？

为改变这一状态，我该怎么做呢？

谢谢！

基本算正常吧。

稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化，有的很明显，比如说细胞变大，生长缓慢，细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等；

有的则变化不明显。

对于稳定转染的细胞，建议筛出单克隆后大量冻存。

一方面防止细胞回复，因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前进，这一点对于肿瘤细胞尤甚；

另一方面，如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话，这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。

在传代过程中，也可以使用正常培养基，但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压，以除去回复的细胞。