糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制.docx

糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制.docx

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糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制

糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

董叫云，牛轶雯，谢挺，青春，陆树良

【摘要】目的通过体外试验探讨糖基化终末产物（AGEs）对表皮角质形成细胞周期调控的影响机制。

方法体外培养的人表皮角质形成细胞经AGEs（150mg/ml）作用后，用噻唑兰（MTT）法研究其增殖活力、流式细胞仪研究细胞周期和凋亡率。

用小片断RNA干扰（siRNA）的方法阻断细胞中AGEs受体（receptorofAGEs,RAGE）mRNA的表达,realtimePCR鉴定其阻断效率。

RTPCR法检测RAGE阻断前后各组细胞内RAF1、黏着斑激酶（FAK）、周期素（cyclin）D1、cyclinB1、周期表依赖性激酶4（CDK4）的核酸水平表达差异。

结果经AGEs干预后表皮角质形成细胞增殖活性下降，凋亡率升高，细胞周期G2期的比例显著增高，而细胞周期调控相关因子及信号因子RAF1、cyclinD1、cyclinB1、CDK4的核酸表达较对照组却明显升高，用RAGE阻断以上因子后表达则与对照组相比无差异。

结论在上述体外模型下，表皮角质形成细胞的周期调控因子升高，而增殖却下降且凋亡增加，可能是AGEs干预后细胞内启动内源性代偿调控机制，且这种调控机制与其受体（RAGE）途径相关;AGEs也可能还通过以上细胞周期调控因子以外的其他途径或机制影响细胞生物学功能。

【关键词】糖基化终末产物;周期素D1;周期素B1;周期素依赖性激酶4;细胞增殖

　　Abstract：

ObjectiveToexplorethemechanismsofdisorderedcellcycleinkeratinocytesthatweremediatedbyadvancedglycationendpruducts（AGEs）invitro.MethodsHumanepidermalkeratinocytes（HEK）wereincubatedwithorwithoutAGEs（150mg/ml）,and150mg/mlBSA（bovineserumalbumin）wassupportedinthenormalmediumascontrolsinthisstudy.After48hoursofincubation,cellapoptosisandcellcycleweredetectedthroughflowcytometer,andthecellgrowthactivitywasassayedbyMTTmethod.ThereceptorsofAGEs（RAGE）wereinterruptedbysiRNA,andthesilencingefficiencywasaffirmedwithrealtimePCR.TheexpressionsofRAF1,FAK,cyclinD1,cyclinB1,CDK4onmRNAlevelswereexaminedwithRTPCRbeforeandaftergenesilencing.ResultsThereducedcellproliferationandincreasedapoptosiswerefoundbyAGEs（150mg/ml）interruption.ThepercentagesofG2stagesincellcyclewereaugmentedsignificantlyandtheexpressionsofcellcyclerelativefactors,suchasRAF1,cyclinD1,cyclinB1,CDK4,wereraisedsignificantlyonmRNAlevelsmediatedbyAGEsbeforegenessilencing.ButtherewerenostatisticaldifferencesinthesefactorsbetweenAGEsgroupandcontrolonesafterRAGEwereinterruptedbysiRNA.ConclusionInthisstudymodel,thephenomenaofincreasedcellcyclerelativefactorsandinhibitedcellproliferationmightbeoneoftheendogenouscompensatingmechanismsinkeratinocytestreatedwithAGEs.ThismechanismwascorrelatedwithRAGEsignalpathway.AGEsmayhaveimpactoncellcycleinotherpathwaysexceptaboverelativefactorsinthestudy.

　　Keywords:

AGEs;cyclinD1;cyclinB1;CDK4;cellproliferation

　　随着人类生活模式的改变，糖尿病已成为新世纪的慢性流行病，目前全世界糖尿病人已近2亿，预测到2025年将上升到3.33亿[1]。

随着糖尿病慢性病程的延长，其并发症发生也越来越普遍，如糖尿病创面难愈是临床的常见现象，近年来关于其治疗手段和病理机制探讨越来越受到关注。

我们课题组经过近十年的研究发现糖尿病大鼠皮肤中糖基化终末产物（AGEs）蓄积增加、参与创面修复的表皮角质形成细胞、成纤维细胞及内皮细胞的活性和功能受抑。

已证实AGEs主要通过AGEs受体（RAGE）途径影响细胞功能[2]。

本研究聚焦于表皮角质形成细胞，旨在探索AGEs对其细胞周期调控蛋白的影响及其可能的机制和途径，试图为临床治疗寻找新的靶点和依据。

　　材料与方法

　　1AGEs的制备

　　参照经典的AGEs制备方法，将牛血清白蛋白（BSA）与葡萄糖在体外共同孵育，使BSA糖基化而形成AGEs产物，具体制备过程及鉴定参见林炜栋等文献[3]，并于-20℃长期保存，同时以磷酸盐缓冲液（PBS）替代葡萄糖，同等条件下与BSA共孵育，作为基质空白对照组的添加物。

　　2细胞培养

　　人表皮角质形成细胞株，HEKC0015C（HumanEpidermalKeratinocytes，C0015C）,在HEK基础培养基EpiLife（MEPI500）中培养，添加HEK生长添加剂HKGS（S0015）。

细胞在37℃、5%CO2培养箱中生长，隔天换液。

用胰酶TE（R001100）消化贴壁细胞，并用中和剂TN（R002100）中和胰酶。

所有试验均选用5～10代的细胞。

细胞分3组：

对照组（control组）:

细胞培养于上述基础培养液中;AGEs组：

细胞以150mg/mlAGEs干预;BSA组：

细胞以150mg/ml基质空白对照液干预。

细胞株及其培养体系均购于Cascade,INC.U.S.A。

　　3MTT检测细胞增殖活性

　　5×104细胞接种于6孔板，待细胞融合至70%，分组刺激24、48小时后，各孔加5mg/mlMTT100ml，37℃培养4小时，弃上清液，各孔加300ml二甲亚砜（DMSO）充分震荡15分钟，将液体吸出移至96孔板100ml/孔，于450nm用全波长酶标仪（SM190,MD,U.S.A）读取吸光度值（OD）。

　　4流式细胞仪检测细胞周期和凋亡

　　细胞接种于25cm2培养瓶中，待生长融合至70%，分组刺激48小时后用TE消化收集细胞，PBS洗涤1次，用膜联蛋白V异硫氰酸荧光黄（AnnexinVFITC）和碘化丙啶（propidiumiodide,PI）标记细胞,室温下避光孵育15分钟，经流式细胞仪进行凋亡检测;用脱氧核糖核酸（RNA）酶，表面活性剂TritonX10037℃水浴15分钟，再加入PI混匀，经流式细胞仪进行细胞周期检测。

用Lysis软件分析细胞周期（分为G1期、S期、G2期）及凋亡比例。

　　5siRNA干扰

　　细胞接种于6孔板，依上所述在基础培养体系中生长，待融合至70%进行RNA干扰。

用300μml0.1%二乙基焦磷酰胺（DEPC）水溶解RAGEsiRNA（sc36374,SantaCruz）至10μmol/l,每孔用800μl不含HKGS的EpiLife与10μlsiRNA充分混匀，再加入12ml转染试剂（13778150,Invitrogen,US），室温孵育30分钟。

另按此比例配制600μl不含RAGEsiRNA的混合液，作为阴性对照。

用不含HKGS的EpiLife培液清洗细胞，后加入600μl/孔上述混合液，37℃、5%CO2培养4小时,再加入含HKGS的EpiLife培液继续培养48小时，收集细胞标本，进行干预结果的检测。

　　6细胞核酸提取及PCR检测

　　细胞经TE消化后，用冷PBS清洗1次，依照Trizol（15596026,Invitrogen）说明书所述步骤，提取细胞总RNA。

逆转录体系为两步法：

（1）oligo（dT）2μl、RNA4mg、加水至24μl,72℃5分钟;

（2）5×转录缓冲液10μl、核苷酸混合物3μl、RNA酶抑制剂1μl、逆转录酶2μl,42℃60分钟。

逆转录所用试剂均购于promega公司。

实时定量PCR检测:

10mlFQPCRPremix（sybergreen）（轩昊科技）、2μl引物（2μM）、1μlcDNA、7μlH2O。

95℃15分钟;95℃15秒、60℃40秒,40个循环;95℃15秒、60℃1分钟、95℃15秒。

用ABI7500实时定量荧光PCR仪进行扩增和检测。

PCR检测：

0.125μlHSTaq、2.5μl10×PCR缓冲液、2μl核苷酸、1μl引物（20μM）、1μlcDNA、18.375μlH2O，所用试剂均购于Takara（DR001）。

94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，35个循环，72℃5分钟。

用TGradiant梯度PCR仪（Biometra,德国）进行扩增。

产物经2%agroseGel、80v电泳，凝胶图像分析仪UniversalHood（BioRad）摄取图像，用QuantityOne进行灰度值计算和数据分析。

目的引物的条带灰度值均与标本所对应的内参GAPDH灰度值相比，得出相对表达量。

所用引物均由Invitrogen合成。

引物序列：

　　GAPDHup5’AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3’

　　down5’GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT3’

　　RAGEup5’CAGTGTGGCTCGTGTCCTTC3’

　　down5’CCGTGAGTTCAGAGGCAGAAT3’

　　RAF1up5’AGCAGCAGAGCTGTCCAT3’

　　down5’CAACAAACGCCTCCTAAAT3’

　　FAKup5’GCTCCACCAAAGAAACCG3’

　　down5’GCCCGTCACATTCTCGTA3’

　　cyclinB1up5’GTTGGTTTCTGCTGGGTG3’

　　down5’CATGTTGATCTTCGCCTTA3’

　　cyclinD1up5’AACACGGCTCACGCTTAC3’

　　down5’CCAGACCCTCAGACTTGC3’

　　CDK4up5’CAAGTGGTGGAACAGTCAA3’

　　down5’GCCCAATCAGGTCAAAGA3’

　　7统计学处理

　　实验数据用±s表示，均数的两两比较采用双样本等方差假设t检验。

差异显著性检验采用SAS6.12统计软件。

P0.05为有统计学差异，P0.01为有显著性差异。

结果

　　1细胞增殖活性

　　用MTT法检测得细胞经AGEs刺激24小时，其OD值0.65±0.21较control组0.68±0.13和BSA组0.72±0.23无统计学差异（P0.05,n=3），AGEs刺激48小时后，细胞增殖活力较control组0.87±0.32vs.1.2±0.35,P0.05以及BSA组0.87±0.32vs.1.32±0.33,P0.01,n=3明显下降。

　　2细胞凋亡

　　细胞经AGEs干预48小时后，其早期凋亡率（AnnexinV单阳性）较之control组（2.16±0.37）%vs（1.64±0.31）%,P0.05,n=3以及BSA组（2.16±0.37）%vs（1.46±0.34）%，P0.05,n=3显著增高。

　　3细胞增殖周期

　　细胞经AGEs干预48小时后，细胞进入S期的比例没有显著变化，而G2期细胞比例则显著高于control组17±5vs10±3,P0.05，n=3;以及BSA组17±5vs.7±2,P0.01，n=3，且发现AGEs组S期/G2期比例倒置。

BSA组细胞S期所占比例较control组显著增高20±7vs.14±4,P0.05，n=3（见表1）。

表1流式细胞仪细胞周期检测

　　4siRNA干扰

　　实时定量PCR扩增曲线显示经siRNA干扰后，RAGE的荧光信号值低微，溶解曲线呈多碎片杂带状。

其扩增产物经Agrose电泳分离，显示干扰后的标本未见RAGE特异性表达，而正常对照组和空白对照组均有表达，说明RAGE的表达在核酸水平被阻断（见图1）。

　　5RAGE阻断前后RTPCR法检测HEK中RAF1、黏着斑激酶（focaladhesionkinase，FAK）、周期素（cyclin）D1、cyclinB1、周期素依赖性激酶4（CDK4）的mRNA表达水平：

RAGE阻断前AGEs组RAF1、cyclinD1、CDK4的表达较control组有所升高0.32±0.07vs.0.16±0.02,P0.05;0.82±0.21vs.0.73±0.19,P0.05;1.93±0.54vs.1.49±0.37,P0.05,n=3。

与BSA组相比有显著性差异0.03±0.0,P0.01;0.56±0.12,P0.01;0.75±0.27,P0.01,n=3。

BSA组RAF1、cyclinB1与control组相比较有显著性差异0.03±0.0vs.0.16±0.02,P0.01;0.3±0.07vs.1.65±0.57，P0.01,n=3。

RAGE阻断后RAF1、cyclinD1、CDK4的表达水平与两对照组相比均无统计学差异P0.05。

AGEs组FAK的表达在RAGE阻断前后与control组和BSA组相比较都无统计学差异P0.05。

AGEs组cyclinB1在RAGE阻断前表达高于BSA组1.32±0.34vs.0.3±0.07,P0.05;与control组比较无统计学差异1.32±0.34vs.1.65±0.57,P0.05;RAGE阻断后AGEs组cyclinB1的均高于两对照组1.01±0.25vs.0.66±0.19,P0.05;1.01±0.25vs.0.37±0.06,P0.05。

BSA组见图2a、b。

　　讨论

　　细胞的增殖和凋亡通常处于平衡稳态中，当有外界因素刺激诱导时，这种稳态失衡，就会发生一系列的生理病理变化。

依据以往的研究，在糖尿病大鼠模型和体外细胞培养的高糖及AGEs体系中均发现了细胞增殖受抑、凋亡率增加的情况[4-6]。

依照前期研究的细胞培养体系，选用150mg/mlAGEs干预细胞，经24、48小时刺激所得细胞活力数据，发现干预24小时后HEK增殖活性与对照组相似，而干预48小时后HEK增殖活性明显受抑，说明150mg/mlAGEs干预有时效性，故将150mg/mlAGEs干预48小时定为体外固定模型进行后续的一系列研究。

　　细胞增殖周期中G1期进入S期和G2期进入M期分别是调控细胞分裂的两个关键点[7]，我们发现HEK经AGEs刺激后G1期的细胞显著减少，G2期的细胞明显增多，说明G2至M期的转化受阻。

且S期和G2期的比例较两对照组明显倒置，说明细胞周期处于失衡状态。

细胞周期受众多因素调控，其中CDK4是细胞周期重要的调节蛋白，它与CyclinD1形成复合物而活化，是细胞从G1期进入S期的必要条件。

而CDK4相关的细胞周期调控异常被认为是肿瘤发生的一个基本机制，近年来受到国内外广泛关注。

RAF1是MAPK的上游信号调节蛋白，它可活化MAPK继而激活cyclinD参与细胞增殖周期的调控。

我们发现经AGEs刺激后HEK中cyclinD1、CDK4和RAF1的mRNA表达均显著升高，这一结果与期G1期细胞所占比例减少相符。

cyclinB1是细胞G2期向M期转化的重要调控因子[8],在我们的体外培养体系中，AGEs组细胞cyclinB1的mRNA表达较基质对照组显著升高，而低于正常对照组，这一结果与G2期比例增高相符，但有悖于细胞增殖活性受阻的现相。

细胞有丝分裂是一个精密而有序的过程，其中任何一个环节受影响都可导致增殖异常（障碍或失控）。

我们研究所示，虽然G2期比例升高，但纵观总体S期与G2期的比例倒置，说明细胞过度滞留于G2期，同时M期作为有丝分裂期，又分前、中、后、末期，内中任一环节的滞留都会影响细胞的有丝分裂，从而阻碍其增殖。

另外，AGEs对细胞增殖活性的抑制，并非仅通过以上调控因子来实现，也可能还有其他途径影响细胞增殖，有待我们进一步探索。

　　特别值得一提的是，因本研究体系中是以BSA糖基化后来模拟糖基化终末产物AGEs的，故特设BSA基质对照组。

研究中发现：

BSA基质对照组中细胞S期所占比例较正常对照组显著增高，G2期所占比例相对减少，且细胞呈现增殖能力活跃、凋亡率低的现象，而细胞周期调节蛋白或（和）调控因子如RAF1和cyclinB1的表达又皆低于正常对照组。

BSA作为本研究基质对照组的添加物，它有利于细胞生长的特性有目共睹，常作为促细胞生长的添加剂而用于体外培养体系中。

由于参与细胞周期调控的因素众多，可能BSA内中所含某些物质也-可通过除RAF1和cyclinB1之外的细胞周期调控因子促进细胞增殖。

以上结果说明，对于HEK而言，BSA所含外源性因子可供细胞增殖需要，而无需再调动过多内源性因子。

细胞受外界因素刺激，调动一系列内源性因子，继而维持、激活或抑制细胞活性，是细胞应对外界刺激的正常生理反应，AGEs组虽大量调动内源性因子（如RAF1等表达显著高于正常对照组），但其最终所致的效果，即细胞增殖效应明显下降，与BSA呈现相反的刺激效应，也进一步说明了一些功能蛋白（如BSA）被糖基化后，对细胞的生物学效应会产生不良变化的现象[9]。

　　AGEs主要通过与位于细胞表面的受体RAGE结合，引起级联反应，诱导氧化应激、组织特异性炎症和凋亡[10]，因而抑制其受体有助于我们探讨其调控细胞周期的机制。

RNA干扰（RNAi）是由双链RNA（doublestrandsRNA,dsRNA）引起的,广泛存在于动植物中，dsRNA经过酶切后形成很多小片段，称为siRNA，而这些小片段一旦与mRNA中同源序列互补結合，就会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，这种利用其序列特异性转录后的的基因沉默（genesilencing）过程，是生物体在演化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制。

本研究用siRNA干扰的方法成功地在体外阻断了RAGEmRNA水平的表达。

我们发现RAGE阻断后由AGEs刺激所引起的RAF1、CDK4、cyclinD1的mRNA水平皆接近于对照组细胞，仅cyclinB1的表达仍较高。

基质对照组的cyclinB1也依旧处于较低水平。

说明在本研究体系中AGEs对细胞增殖周期相关调控蛋白RAF1CDK4cyclinD1级联的调控与RAGE途经相关。

而对于cyclinB1的激活可能主要是由其他途径引起的。

同时发现FAK在RAGE阻断前后各组表达水平皆无统计学差异。

FAK是一种非受体型胞浆酪氨酸激酶，FAK信号通路可以转导信号，调节细胞的增殖、转移和生存等多种功能。

其中FAKRasRAFMEKERKcyclinD这一级联反应也已得到广泛证实和认可，它的活性可受许多细胞外因素刺激的调控。

而依照本研究所示，细胞由AGEs刺激所引起的相关反应可能对FAK无显著影响，RAF等后续级联因子或许是由FAK以外的其他途径来激活的。

　　在研究中我们惊奇地发现，siRNA干扰试验本身对细胞也有影响，它不仅可以有效抑制目标RNA的表达，对其他因子RNA的表达也有一定程度的抑制作用，如siRNA阴性对照组的RAGEmRNA表达也下降了30%左右，同时显微镜观察发现，siRNA干扰过程中细胞膜多皱折、胞体变大，胞浆多空泡，显示细胞生长状态不佳。

但换成基质培液后16小时，细胞形态又恢复正常。

因而为避免siRNA干扰对细胞影响所致实验数据误差，本文仅分别对干扰前各组，和干扰后各组的数据进行统计分析，而不再进行干扰前后同组数据的对比。

　　总之，在上述体外模型下，表皮角质形成细胞的周期调控因子升高，而增殖却下降且凋亡增加，可能是AGEs干预后细胞内启动内源性代偿调控机制，且这种调控机制与其受体（RAGE）途径相关;AGEs也可能还通过以上细胞周期调控因子以外的其他途径或机制影响细胞生物学功能。

而糖尿病创面难愈、愈合延迟以及老年人皮肤易溃破、褥疮等是临床治疗所面临的棘手问题，而这些现象与皮肤AGEs蓄积密切相关。

因生长因子等促进创面愈合的药物价格昂贵，只能给予局部范围的应用，而如糖尿病等病症是全身性的皮肤病理改变，局部应用促愈合药物也只是治标不治本的手段，RAGE是AGEs影响细胞功能的主要途径，阻断RAGE的表达，继而有效减弱AGEs对细胞及机体的作用，对于改善皮肤微环境[11]有着重要意义，不失为一种经济而有效的治疗手段。

希望本研究可为临床的治疗探索提供些许帮助和理论依据。

【参考文献】

　[1]WildS,RoglicG,GreenA,etal.Globalprevalenceofdiabetes:

estimatesfortheyear2000andprojectionsfor2030[J].DiabetesCare,2004,27（5）:

1047-1053.

　　[2]WendtT,TanjlN,GuoJ,etal.Glucose,glycation,andRAGE:

implicationsforamplificationofcellulardysfunctionindiabeticnephropathy[J].JAmSocNephrol,2003,14（5）:

1383-1395.

　　[3]林炜栋，陆树良，青春,等.晚期糖基化终末产物修饰人血清白蛋白对人血管内皮细胞的生长抑制作用[J].中华医学杂志，2003,83（7）:

572-576.

　　[4]JiaoyunD,YoshihiroT,HideharuT，etal.Protectiveeffectsof