小鼠晚期糖基化终末产物AGEs酶联免疫分析ELISA.docx
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小鼠晚期糖基化终末产物AGEs酶联免疫分析ELISA
小鼠晚期糖基化终末产物（AGEs）酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒利用说明书
本试剂仅供研究利用目的：
本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中晚期糖基化终末产物（AGEs）含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠晚期糖基化终末产物（AGEs）水平。
用纯化的小鼠晚期糖基化终末产物（AGEs）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入晚期糖基化终末产物（AGEs），再与HRP标记的晚期糖基化终末产物（AGEs）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，通过完全洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的晚期糖基化终末产物（AGEs）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠晚期糖基化终末产物（AGEs）浓度。
试剂盒组成：
试剂盒组成
48孔配置
96孔配置
保存
说明书
1份
1份
封板膜
2片（48）
2片（96）
密封袋
1个
1个
酶标包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
标准品：
720ng/L
×1瓶
×1瓶
2-8℃保存
标准品稀释液
×1瓶
×1瓶
2-8℃保存
酶标试剂
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
样品稀释液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
显色剂A液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
显色剂B液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
终止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
20倍浓缩洗涤液
20ml×1瓶
30ml×1瓶
2-8℃保存
样本处置及要求：
1.血清：
室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
认真搜集上清，保留进程中如显现沉淀，应再次离心。
2.血浆：
应依照标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
认真搜集上清，保留进程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：
用无菌管搜集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
认真搜集上清，保留进程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参如实行。
4.细胞培育上清：
检测分泌性的成份时，用无菌管搜集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
认真搜集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
认真搜集上清。
保留进程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：
切割标本后，称取重量。
加入必然量的PBS，。
用液氮迅速冷冻保留备用。
标本融化后仍然维持2-8℃的温度。
加入必然量的PBS（），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
认真搜集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本搜集后及早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
假设不能马上进行实验，可将标本放于-20℃保留，但应幸免反复冻融.
7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：
在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中别离加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl别离加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔别离加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl别离加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中别离加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl别离加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中别离加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中别离取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔别离加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度别离为480ng/L，320ng/L，160ng/L，80ng/L，40ng/L）。
2.加样：
别离设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽可能不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：
用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：
将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
5.洗涤：
警惕揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：
每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：
操作同3。
8.洗涤：
操作同5。
9.显色：
每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：
每孔加终止液50μl，终止反映（现在蓝色立转黄色）。
11.测定：
以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15
分钟之内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中掏出应在室温平稳15-30分钟后方可利用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保留。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不阻碍结果。
3．各步加样均应利用加样器，并常常校对其准确性，以幸免实验误差。
一次加样时刻最好操纵在5分钟内，如标本数量多，推荐利用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量太高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释必然倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性利用，以幸免交叉污染。
6．底物请避光保留。
7．严格依照说明书的操作进行，实验结果判定必需以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各类废弃物都应按传染物处置。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，依照样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为以上。
2.批内与批见应别离小于9%和11%
检测范围：
20ng/L-500ng/L
保留条件及有效期：
1.试剂盒保留：
；2-8℃。
2．有效期：
6个月
Mouseadvancedglycationendproducts
FORRESEARCHUSEONLY
DrugNames
GenericName：
Mouseadvancedglycationendproducts（AGEs）ELISAKit.
Purpose
ThiskitallowsforthedeterminationofAGEsconcentrationsinMouseserum,bloodplasma,andotherbiologicalfluids.
Principleoftheassay
ThekitassayMouseAGEslevelinthesample，usePurifiedMouseAGEsantibodytocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddAGEstowells,CombinedAGEsantibodywhichWithHRPlabeled,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.TheconcentrationofAGEsinthesamplesisthendeterminedbycomparingthe.ofthesamplestothestandardcurve.
Materialsprovidedwiththekit
Materialsprovidedwiththekit
48determinations
96determinations
Storage
Usermanual
1
1
Closureplatemembrane
2
2
Sealedbags
1
1
Microelisastripplate
1
1
2-8℃
Standard：
720ng/L
×1bottle
×1bottle
2-8℃
Standarddiluent
×1bottle
×1bottle
2-8℃
HRP-Conjugatereagent
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
Samplediluent
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
ChromogenSolutionA
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
ChromogenSolutionB
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
StopSolution
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
washsolution
20ml×1bottle
30ml×1bottle
2-8℃
Specimenrequirements
1.serum-coagulationatroomtemperature10-20mins，centrifugation20-minatthespeedof2000-3000removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
2.plasma-usesuitedEDTA,citrateorheparinizedplasmaasananticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugal
again.
3.Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluidReferencetoit.
4.cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000removesupernatant,detectthecompositionofcells,DilutcellsuspensionwithPBS（）,Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagecellsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
5.Tissuesamples-Aftercuttingsamples,checktheweight,addPBS（）,Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-8℃aftermelting,addPBS（）,HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000removesupernatant.
6.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
7.Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.
Assayprocedure
andaddsampletoStandard:
set10StandardwellsontheELISAplatescoated,addStandard100μltothefirstandthesecondwell,thenaddStandarddilution50μltothefirstandthesecondwell,mix;takeout100μlformthefirstandthesecondwellthenaddittothethirdandtheforthwellseparately.thenaddStandarddilution50μltothethirdandtheforthwell,mix;thentakeout50μlfromthethirdandtheforthwelldiscard,add50μltothe
fifthandthesixthwell,thenaddStandarddilution50μltothefifthandthesixthwell,mix;takeout50μlfromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandarddilution50μltotheseventhandtheeighthwell,mix;takeout50μlfromtheseventhandtheeighthwellandaddtotheninthandthetenthwell,addStandarddilution50μltotheninthandthetenthwell,mix,takeout50μlfromtheninthandthetenthwelldiscard（addSample50μltoeachwellafterDiluting,（density:
480ng/L，320ng/L，160ng/L，80ng/L，40ng/L）
sample：
Setblankwellsseparately（blankcomparisonwellsdon’taddsampleandHRP-Conjugatereagent,othereachstepoperationissame）.testingsamplewell.addSampledilution40μltotestingsamplewell,thenaddtestingsample10μl（samplefinaldilutionis5-fold）,addsampletowells,don’ttouchthewellwallasfaraspossible,andGentlymix.
:
AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30minat37℃.
liquid:
washsolutiondiluted20-foldwithdistilledwaterandreserve.
：
UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.
enzyme：
AddHRP-Conjugatereagent50μltoeachwell,exceptblankwell.
：
Operationwith3.
：
Operationwith5.
：
AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat37℃
thereaction：
AddStopSolution50μltoeachwell,Stopthereaction（thebluecolorchangetoyellowcolor）.
：
takeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.
Importantnotes
1.Thekittakesoutfromtherefrigerationenvironmentshouldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseup
afteropened,theplateshouldbestoredinSealedbag.
2.washingbufferwillCrystallizationseparation,itcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.Washingdoesnotaffecttheresult.
3.addSamplewithsamplerEachstep,Andproofreaditsaccuracyfrequently,avoidstheexperimentalerror.addsamplewithin5min,ifthenumberofsampleismuch,recommendtouseVolley.
4.ifthetestingmaterialcontentisexcessivelyhigher（ThesampleODisbiggerthanthefirststandardwell）,pleasediluteSample（n-fold）,Pleasediluenteandmultipliedbythedilutionfactor.（×n×5）.
5.Closureplatemembraneonlylimitsthedisposableuse,toavoidcross-contamination.
6.Thesubstrateevadethelightpreservation.
7.Pleaseaccordingtouseinstructionstrictly,Thetestresultdeterminationmusttakethemicrotiterplatereaderasastandard.
8.Allsamples,washingbufferandeachkindofrejectshouldaccordingtoinfectivematerialprocess.
9.Donotmixreagentswiththosefromotherlots.
Calculate
Assayrange
20ng/L-500ng/L
Storageandvalidity
1．Storage：
2-8℃.
2．validity：
sixmonths.
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