进出口食品中磷脂测定比色法检验检疫标准管理信息系统.docx

进出口食品中磷脂测定比色法检验检疫标准管理信息系统.docx

《进出口食品中磷脂测定比色法检验检疫标准管理信息系统.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《进出口食品中磷脂测定比色法检验检疫标准管理信息系统.docx（19页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

进出口食品中磷脂测定比色法检验检疫标准管理信息系统

《进出口食品中磷脂测定比色法》编制说明

一、标准制定的任务来源及意义

1、任务来源

本标准是根据国家认监委2009B550《进出口食品中磷脂测定比色法》出入境检验检疫行业标准制订计划，由宁波出入境检验检疫局制定。

2、制定本标准的意义

卵磷脂（Lecithin）一词源于希腊语的蛋黄（Lekithos）[1]。

1850年最先由法国科学家MauficeGobley从蛋黄中分离出含磷的脂肪物，并命名为Lecithint，当时尚不知该物质含有多种成分，此时卵磷脂具有广义的概念。

所以，磷脂通常又被称为卵磷脂。

磷脂是一类脂的统称，实际上是混合物，含有多种含磷成分，磷脂主要成分有：

磷脂酰胆碱（俗称卵磷脂，此为狭义的概念），简称PC；磷脂酰胆胺（俗称脑磷脂），简称PE；磷脂酰肌醇（俗称肌醇磷脂），简称PI；磷脂酰甘油（俗称神经鞘磷脂），简称PG；丝氨酸磷脂等其他磷脂；磷脂酸，简称PA等。

目前我们食用磷脂的主要来源是大豆磷脂和蛋黄磷脂。

通常所说的磷脂泛指大豆磷脂，是以大豆磷脂物为主体，并含有中性油和其他非磷脂成分，如色素、糖分、半乳糖苷、脑苷脂类，随着油脂精深加工技术的进步，而今大豆卵磷脂已占到世界磷脂总产量的九成以上，所以下面我们主要介绍大豆磷脂的性质。

天然磷脂普遍存在于动植物细胞的原生质和生物膜中，是构成动物和植物细胞的主要成分。

动物磷脂主要存在于蛋黄、牛奶、动物体脑组织、肝脏、肾脏及肌肉组织中，以蛋黄含量最多；植物磷脂广泛存在于大豆、油菜、花生、葵瓜子等油料种子中，尤其以大豆含量最多。

磷脂大部分存在于胶体相内，并与蛋白质、糖类、脂肪酸、维生素等物质以结合状态存在，是一类重要的油脂伴随物。

大豆磷脂由于其特殊的理化特性，在食品工业上的应用已有很长的历史。

近年来大豆卵磷脂经由特殊改良技术，将其功能及一些物理特性升华，远远超出其自然特性的限制，品质和数量不断增加，从而也促进食品工业的发展。

美国食品与药物管理局（FDA）推荐卵磷脂是“公认为安全的（GRSA）”食品添加剂之一，并载入美国联邦食品法规（CFR）。

卵磷脂可以作为食品配料，在符合美国食品化学品法规（FCC）的规定下，可以无限量地用于食品中。

我国GB2760《磷脂 糖果、糕点、氢化植物油按生产需要适量使用 》规定，磷脂作为抗氧化剂，可使用于糖果、糕点、氢化植物油等，可按生产需要适量使用；改性大豆磷脂作为乳化剂，可用于各类食品，可按生产需要适量使用。

二、磷脂的特性

1、磷脂的性质

磷脂为白色蜡状固体，在低温下可结晶。

磷脂易吸水呈棕黑色胶状物，易氧化，在空气中放置一段时间后，其白色逐渐变成褐色，最后呈棕黑色，这是因为分子中大量不饱和脂肪酸被空气氧化所致。

磷脂不耐高温，100℃以下即氧化，直至分解，280℃生成黑色沉淀[2]。

大豆磷脂是一种淡黄色至棕色、无嗅或略带有气味的粘稠状或粉末状物质[3]。

从其结构上看，它是一种表面活性剂，两个脂肪酸链为疏水基，磷酸及胆碱等基团为亲水基，因此具有一系列界面性质和胶体性质。

大豆磷脂不溶于水，易溶于多种有机溶剂，易形成反胶团，即疏水基在外，亲水基在内。

乳化性是磷脂的重要特性，在大豆磷脂中，醇溶的（富集了卵磷脂）易形成OPW型乳液，而醇不溶的（富集了脑磷脂）易形成WPO型乳液。

由于大豆磷脂分子中存在大量不饱和脂肪酸，很容易被空气氧化，而温度的升高不仅加快此种氧化的发生，而且使其颜色逐渐加深。

因此，在使用或保存大豆磷脂时，应注意控制温度或加入适当的抗氧化剂。

大豆磷脂也能形成液晶，包括热致液晶和溶致液晶。

大豆磷脂产品从其性状上可分为液态、膏状、粉状；从其工艺上可分为粗磷脂、浓缩磷脂、高浓缩磷脂和改性磷脂，其物理性质归纳如下：

大豆磷脂为棕到浅黄色，深浅程度由脱色而定。

如精制磷脂无臭气、味道温和。

磷脂的稠度视所含脂肪酸量而变，可从塑状态到液体状态；大豆磷脂不溶于丙酮，但能溶解于甘油酯载体、脂肪酸等，利用这一特性可使磷脂分离、提纯和测定。

大豆磷脂不溶于水，但在水中膨润、呈胶体溶液；纯大豆磷脂在空气中或阳光照射下不稳定，会很快氧化、变色。

但如有少量豆油存在便能起到保护作用，使磷脂不发生变质。

大豆磷脂不耐高温，80℃就开始变为棕色，到120℃就开始分解。

据研究，磷脂在加热初期先生成共轭二烯化合物，再通过胆碱和磷脂的接触作用，羰基化合物进行了聚合，磷脂的综合反应主要是磷脂酰胆碱起作用；大豆磷脂具有吸湿性，在热水或pH值为8以上时更容易乳化，磷脂中的卵磷脂其脂肪酸组分是非极性的，在分子的一端具有强的亲脂性的脂肪酸核，在另一端则是强亲水的氨基或磷酸核，因而大豆卵磷脂是极少数天然食用的油溶性或油分散性表面活性剂之一。

在非均匀的体系中，磷脂分子排成单分子膜，脂肪酸核朝向亲油性表面，而磷酸或氨基则面向亲水性的表面，经过这样的排列后，可使非均匀体系的交界处的表面张力降低，从而很快起到润湿作用，使粘度降低，使乳化作用和分散作用得到稳定。

磷脂不溶于水，但可溶胀形成骨髓状的胶体磷脂可溶于脂肪烃，芳香烃，卤代烃类有机溶剂。

只部分溶于脂肪族的醇类，如乙醇，向其它非极性表面活性剂一样，不溶于极性的溶剂。

如丙酮；但有少量油脂存在时，磷脂于丙酮注注溶解度即增加卵磷脂可溶解于乙醇中，而脑磷脂则不溶解于乙中。

利用磷脂在上述溶剂中溶解度的差异，可作分离提纯及定量磷脂的依据。

磷脂能溶于动植物脂，矿物油及脂肪酸中，实际上不溶于冷的动植物脂。

大豆磷脂中主要成分的结构多为酰基，其化学结构式为[4]：

式中R1、R2是C14~C20的饱和或不饱和脂肪羧酸，而X的不同则构成不同的磷脂。

大豆磷脂的化学性质主要表现在它的酯键、脂肪酸链和磷脂的X取代基上。

大豆磷脂在酸性或碱性条件下，加热或煮沸时，可发生完全水解反应，生成游离脂肪酸、甘油、肌醇和磷酸等小分子产物。

在特殊的磷脂酶作用下，大豆磷脂可发生部分水解，如蛇卵磷脂酶，能专一作用于磷脂的不饱和脂肪酸酯键，使其分解。

由于大豆磷脂分子中含有不饱和脂肪酸,故其中的不饱和键可以发生各种加成反应。

在乳酸等有机酸存在下，大豆磷脂与过氧化氢反应，使其不饱和键部分羟基化。

在镍等催化剂存在下，大豆磷脂可与氢气发生加成反应,生成饱和磷脂。

在一定条件下，大豆磷脂可与卤素、氢卤酸等进行加成，生产卤代产物。

磷脂酰乙醇胺分子中的胺基，可与酸酐等酰化试剂反应,生成酰化产物。

2、磷脂的作用

磷脂的作用主要有以下几个方面：

一是调整机体膜功能：

细胞膜主要是由磷脂、蛋白质和胆固醇组成的，共同承担着代谢过程中供应细胞维持生命所必需的物质和排出废物等功能。

增加磷脂的摄入量，能有效地改善膜功能，提高机体的代谢能力、自愈能力和机体组织的再生能力；二是促进和改善脂肪吸收：

磷脂具有良好的乳化性和分期性，它能将进入动物小肠内的脂肪进一步分期，增大脂肪与肠粘膜的接触面积，增加吸收机会，从而提高脂肪的吸收和利用；三是磷脂能保护和增强肝脏的功能：

胆碱对脂肪具有较强的亲合能力，它可以结合动物体内的脂肪，并以磷脂的形式由肝脏通过自由血液循环代谢。

卵磷脂所释放出来的胆碱能将肝脏中堆积或新合成的脂肪及时代谢，从而减低脂肪肝的发病率；四是保护胃粘膜不受损伤：

研究表明，磷脂主要作用于泌酸区粘膜上粘液，特别是其表面上皮含量丰富。

其表面活性磷脂对胃粘膜具有保护作用；五是维护生物膜上酶的活性：

生物膜上的许多酶活性与磷脂关系密切，供给足够的磷脂是维持膜酶高活性的物质保证。

随着科技的进步，磷脂的应用越来越受到人们的重视，大豆磷脂能提高烘焙食品的加工性能，磷脂在食品中的应用如表1。

表1卵磷脂的主要应用领域及主要用途

应用产品

可用大豆卵磷脂类型

作用

人造奶油、食用油

精制卵磷脂、羟基改性卵磷脂

乳化、增加营养成分、改善口感

肉类产品、水产品

精制卵磷脂、粉末卵磷脂

乳化、增加营养成分、润滑脱模

巧克力

精制卵磷脂

乳化、改善黏度、防止起霜、润滑脱模

面包、点心

精制卵磷脂、脱脂卵磷脂、

羟基化卵磷脂

乳化、抗氧化防止老化、添加营养

饼干

精制卵磷脂、脱脂卵磷脂、

羟基化卵磷脂

抗氧化防止老化、添加营养

糖果

精制卵磷脂、粉末卵磷脂

乳化、改善粘性

冰淇淋

精制卵磷脂、羟基化卵磷脂

乳化、改善稳定性、提高起泡、分散性

3磷脂的测定方法[5~8]

磷脂总含量的测定方法有称重法、比色法、紫外分光光度法等；磷脂不同组分的分离和测定方法有TLC、HPLC和31P-NMR等；利用RP-HPLC和GC可以对磷脂的脂肪酸的组成分析测定；使用HPLC、GC等和MS的联合使用可以对磷脂分子量及分子结构进行分析。

称量法有两种:

一种是将磷脂混合物用浓硫酸和浓硝酸混合物分解，使磷变成正磷酸根离子，再将后者转化成为磷钼酸铵沉淀称量；另一种方法是利用油脂溶于丙酮而磷脂不溶于丙酮的性质，用丙酮萃取样品，除去油脂，烘干残留物，称量即得磷脂含量，这种方法主要适用于植物油脂中磷脂总量的测定，其优点是操作简单，但其测定值并非磷脂真实值。

比色法有钼蓝比色法、硫氰亚铁胺比色法和酶法比色法之分，三者在磷脂检测上均有应用。

钼蓝比色法是将样品与金属氧化物灰化，试样中的磷变为磷酸盐，加酸溶解而得磷酸根，在加入钼酸盐后生成磷钼酸盐，磷钼酸盐被还原而产生钼蓝，其颜色深浅与磷脂含量成正比关系，由此可进行比色定量。

该法容易受样品中无机磷的影响，而使测定值偏高。

高氯酸-浓硫酸-钼锑抗比色法也有报道，它是在钼蓝比色法的基础上发展而来的，由于用强酸消化使分析时间大大缩短，同时用2,6-二硝基酚作酸碱指示剂，从而使显色更加准确。

硫氰亚铁胺比色法原理是：

红色硫氰亚铁胺化合物不溶于氯仿，但与磷脂形成的复合物可溶于氯仿，按磷脂和硫氰亚铁胺形成的复合物所产生的颜色于488nm测定吸光度，从而测定出磷脂含量，该法特点是不需要消化，测试时间短。

酶法比色法是利用磷脂酶水解磷脂，然后测定其释放出的产物，在500nm处测定其吸光度值，由于该法测定成本较高，所以应用的并不是很多。

二阶导数紫外分光光度UV法磷脂吸收光谱有两个峰，一个处在240nm左右，一个处在273nm左右，前者吸光度比后者强得多，测定240nm左右的峰和谷通常为247nm的峰和239nm谷之间的垂直距离D，D与浓度成正比。

其优点是不需经过分离就可直接测定，操作简单、精密度好、回收率高以及相关系数好，但测定值不能完全反映真实值。

红外光谱FTIR法由于C=O、PO2、P-O-C的吸收振动,在磷脂定量分析过程中产生5个谱带：

1765~1720nm；1200~1145nm；1145~970nm；1200～970nm；830~740nm。

可用于测定毛油和脱胶油中含磷量的谱带是1200~970nm谱带，该谱带的振动是由P-O-C和PO2基团产生的。

由于非磷脂成分的C=O基团振动产生的吸收也在1765~1720nm区域内，所以1765~1720nm谱带不能用于准确测定磷脂含量。

在1200～970nm内产生的振动吸收通过计算机程序进行统计分析，产生线性回归方程以及把磷脂键面积转换为磷脂浓度的皮尔森相关系数，然后计算出磷脂含量。

FTIR法与钼蓝比色法相比具有分析速度快、操作简单、可重复性好、效率高等优点。

薄层色谱TLC法是将磷脂用硅胶板上行法展层，展开后的板喷布磷脂显色剂。

各种磷脂的定量，可采用薄层色谱扫描仪计算积分值，或将磷脂的斑点刮下来，然后测定磷含量。

TLC法可分为单向和双向两种：

单向TLC能够同时分析几个样品，但很难将组分完全分开；双向TLC可将磷脂各组分完全分开，但是它一次只能分析一个样品。

TLC法通常采用的显色剂有:

碘蒸气、Dittmer-lester钼蓝显色剂、Dragendorff试剂、Vaskovsky试剂和茚三酮等。

近年来，国外有许多文章报道采用高效液相色谱HPLC分析磷脂，因为HPLC能使非挥发性的、热敏感的磷脂在常温得到分离，它的封闭系统减少了磷脂在分析过程中被氧化的可能性，确保实现磷脂的快速、灵敏、准确的定量分析。

HPLC法一般分为反相高效液相色谱RP-HPLC和正相高效液相色谱法NP-HPLC，RP-HPLC法的分析时间一般比较短，但分离效果不如NP-HPLC法。

核磁共振NMR技术用于磷脂的分析是20世纪90年代才发展成熟的新技术，它利用磷原子的31P的核磁共振效应来分析各种磷脂的组成和含量的，由于不同类型的磷脂化学环境不同，31P的化学位移也不同，由此来确定各种不同磷脂的种类，各种磷脂的含量由核磁响应信号的积分确定。

ThomasGlonek用核磁共振分析了乙醇分提富集PC的磷脂的各组分含量，磷脂用甲醇-氯仿溶解，再用EDTA溶液沉淀其中的高价的金属离子，消除其对31P-NMR的干扰，核磁共振在20214MHz下对磷脂进行分析。

三、标准化过程国内外现状和技术路线的选择

本标准在磷的检测部分参考“GB/T5537-2008粮油检验磷脂含量的测定[9]”的标准方法；本标准样品的提取部分查阅了相关最新资料和文献[1~5]，结合我国国情和国内实验室的特点，研制了一种从食品中提取出磷脂的方法：

用体积比为2：

1的氯仿甲醇溶液提取样品，样品提取物经灼烧成为五氧化二磷，被热盐酸变成磷酸，遇钼酸钠生成磷钼酸钠，用硫酸联氨还原成钼蓝，用分光光度计在波长650nm，测定钼蓝的吸光度，与标准曲线比较，计算其含量。

国内相关标准如下：

GB/T22506-2008粮油检验酶改性磷脂中1-和2-溶血磷脂酰胆碱的测定高效液相色谱法[10]，但此标准只检测磷脂中的两种物质；GB/T23878-2009饲料添加剂大豆磷脂[11]；SB/T10206-1994磷脂通用技术条件[12]；DIN10468牛奶和牛奶制品中磷脂值的测定[13]。

标准GB/T23878-2009、SB/T10206-1994为纯食品添加剂的检测。

李树立[14]等人采用不同的萃取剂将磷脂与无机磷化合物分离，然后灰化，在690nm处比色测定磷含量，再换算为磷脂含量，确定最佳萃取剂为氯仿：

甲醇为2：

1，并对方法的准确度进行了验证；王治宝[15]等人用氯仿提取口蘑中的总磷脂，在索氏提取器中60℃水浴回流3h，经消化后采用钼酸铵比色法测定总磷脂含量；袁金斌[16]等人采用硝酸-高氯酸法消解样品，使样品中的卵磷脂定量转化为正磷酸盐，用氯化亚锡还原，基于钼蓝法的大豆总卵磷脂含量测定方法；将供检样品粉碎、脱脂，再过柱[17]（将活化的硅胶，按每分离1g样品用8g的比例，用正己烷混匀装柱），以苯-乙醚（9+1）、乙醚各300mL依次洗脱溶出中性物质。

用200mL三氯甲烷、100mL含5%丙酮的三氯甲烷洗脱，溶出糖质。

再用100mL含10%甲醇的丙酮、400mL甲醇洗脱，得磷脂，然后用高氯酸消解，分光光度法检测。

从以上标准与文献可以看出，现在还没有检测食品中磷脂的相关标准，一些文献有食品中磷脂含量检测的探讨。

从以上标准和文献可以看出，现在只有检测粮油中的磷脂含量的标准，还没有检测食品中磷脂含量胡标准。

本标准检测方法能够对鸡肝、猪肾等肉制品；鸡蛋、花生、牛奶、糖果等食品中的磷脂进行分析，同时对确定的检测方法进行检出限，回收率、精密度等试验，建立了一个灵敏度高、选择性好，样品适用范围宽，能为我国大多数检验检疫机构所适用的方法。

四、标准化过程

2010年1~5月进行了资料查阅、调查研究和整理，初步确定技术路线，并成立起草小组，任务分工，实验前期准备。

2010年6~9月，进行了样品前处理的摸索，包括样品前处理步骤的优化，收集条件试验数据。

2010年10~12月对不同基质，如鸡蛋、花生、牛奶、糖果、鸡肝、猪肾等进行方法验证试验，同时收集整理数据。

2011年1~8月进行实验室间的协同试验和验证工作，完成工作报告、标准的征求意见稿。

2011年8~至今完成意见汇总的整理，并修改征求意见稿，完成送审稿。

五、编制依据

本标准遵循GB/T1.1-2000《标准化工作导则：

第1部分:

标准的结构和编写规则》的编写规则及GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：

化学分析方法》编写规则的要求。

六、主要实验技术论证

1、检测方法的选择

由于本实验对磷的检测是参考“GB/T5537-2008粮油检验磷脂含量的测定”标准方法，对食品中磷脂的萃取主要是参考相关的文献与书籍，所以本标准主要考察了食品中磷脂的萃取情况，提取物按照GB/T5537-2008的标准方法即比色法进行操作。

GB/T5537-2008标准的实验原理为：

含有磷脂的试样与金属氧化物灰化时，试样中的磷成为磷酸盐，再加酸溶解而得磷酸根，在加入钼酸盐后生成磷钼酸盐。

磷钼酸盐被还原成蓝色的络合物钼蓝，产生蓝色的深度与磷的含量成正比。

将被测液与标准溶液在相同条件下比色定量，即可测得磷的含量。

将磷的含量再乘以相应的换算系数，即得磷脂的含量。

其主要反应如下[18]：

2前处理研究

2.1提取溶剂的考察

食品中磷脂常用的提取方法可归纳为三大类：

一是物理萃取法[8]，即用超临界流体技术（SFE-CO2），这是一种新型的分离技术，其操作简单，萃取纯度较高；二是化学萃取法，即用氯仿、甲醇、丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂反复萃取，其操作步骤较复杂；三是索氏提取法，即在索氏提取器中加入样品与提取试剂萃取，其操作耗时。

本标准选用化学萃取法对食品中的磷脂进行提取。

食品中含磷的物质除磷脂外还有无机磷酸盐、植酸盐及核酸盐等，所以不能采取直接灰化的方法进行检测。

本标准采用合适的溶剂进行化学萃取法提取食品中的磷脂含量。

操作中采用了氯仿、甲醇、乙醚、90℃~120℃石油醚等有机溶剂进行萃取，萃取时间均为30min，后续操作条件按照标准要求操作，结果见表2。

氯仿甲醇的配比对磷脂萃取的影响结果见表3。

表2不同萃取溶剂对磷脂萃取的影响

样品

大豆

花生

鸡心

萃取溶剂

测定值，mg/g

测定值，mg/g

测定值，mg/g

乙醚

4.05

2.23

5.32

90℃~120℃石油醚

4.22

2.32

5.05

氯仿

17.2

7.75

19.2

甲醇

17.8

7.67

18.7

氯仿：

甲醇（2：

1）

23.7

9.25

22.9

表3氯仿甲醇的配比对磷脂萃取的影响

样品

大豆

花生

鸡心

牛奶

萃取溶剂

测定值，mg/g

测定值，mg/g

测定值，mg/g

测定值，mg/g

氯仿：

甲醇（1：

1）

22.9

9.11

21.9

13.5

氯仿：

甲醇（2：

1）

23.7

9.25

22.9

14.8

氯仿：

甲醇（3：

1）

23.5

9.31

22.7

14.5

氯仿：

甲醇（5：

1）

22.5

8.93

21.2

13.1

大豆营养成份主要为蛋白质、异黄酮、低聚糖、皂苷、磷脂、核酸，还包括钙、磷等微量元素等。

大豆中营养成分中磷脂大约为1.5%~3%，微量元素大约为4%~4.5%。

花生中含丰富的脂肪油，油中含多种脂肪酸的甘油酯，其不饱和脂肪酸占80%以上；又含较丰富的蛋白质，多种人体必需的氨基酸、卵磷脂、嘌呤、胆碱、胡萝卜素、维生素B1、B2、E，泛酸、钙、磷、铁、甾醇、三萜皂甙、纤维素，花生种皮含脂质、甾醇、鞣质等。

牛奶的营养成份很高，牛奶中的矿物质种类也非常丰富，除了我们所熟知的钙以外，磷、铁、锌、铜、锰、钼的含量都很多，其它种类复杂，至少有100多种，主要成份由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等组成。

对于动物产品磷脂是动物细胞膜的重要组分之一，具有广泛的生理活性。

研究表明，动物肝脏中磷脂丰富，相较于植物源卵磷脂，动物肝脏中磷脂不饱和脂肪酸含量更高，并含有一些特有的功能分子。

从上面各种样品的基本信息可以看出，大豆、花生、牛奶等样品中磷的存在形式不仅为卵磷脂，还有以无机形态存在的磷，所以不能以直接灰化的方法对食品中的磷进行检测。

选择提取磷脂的溶剂较重要，因磷脂在植物体中以结合态形式存在，而添加到食品中的磷脂又分散在食品中。

用提取脂类最有效的溶剂氯仿-甲醇不仅会把产品本身所含的磷脂提取出来（虽然量较低），而且还可以把添加到食品中的磷脂萃取到溶剂中，而用乙醚等溶剂则不能将食品本身所含的磷脂提取出来[19]，只能将添加到食品中的磷脂萃取到溶剂中。

本研究检测的是食品中磷脂含量，即包括食品本身含有的磷脂，也包括外部添加进去的磷脂，所以本研究采用提取脂类最有效的溶剂氯仿-甲醇溶液作为食品中磷脂的萃取溶剂。

从表2中数据可以看出，用乙醚、90℃~120℃石油醚作为萃取溶剂时，对食品中磷脂的提取效果较差，而单用氯仿或甲醇作为溶剂时，这两种溶剂对样品的萃取效果也较差，只有当这两种溶剂协同作用，按一定比例配比时才能发挥出很好的提取效果。

究其原因，大概是因为氯仿虽然具有好的萃取效果，但它的亲水性不强，不能很好的与样品接触从而提取出样品中的磷脂；甲醇虽然具有很好的亲水性，但它对磷脂的提取效果不强，所以两者要按照一定的比例混合才能达到对样品中磷脂很好的提取效果，表3列出了氯仿、甲醇的配比对样品的提出效果。

从表3中数据可以看出，当氯仿与甲醇的配比为2：

1或为3：

1时，溶剂对样品中磷脂的提取效果较好。

在实验的基础上，再参考相关的资料[20~23]，本次实验选择氯仿与甲醇的配比为2：

1的溶剂作为样品的提取溶剂。

样品经过萃取离心后，有部分样品与溶剂分离不是很好，需要用G3坩埚进行过滤，滤器的选择也是比较重要。

滤纸过滤对磷脂有一定的吸附作用[21]，难以洗涤完全，用G3坩埚可以达到过滤效果，用少量萃取溶剂洗涤后可以回收完全，所以本研究选择用G3坩埚进行过滤。

2.2称样量的确定

影响检测样品称样量多少主要因素是样品中磷脂含量的多少从而使样品的萃取物经过处理后的吸光度在标准曲线范围内（当然也可以根据吸光度的大小调整比色时所取的被测液的体积），一般根据样品中磷脂含量称取2g~5g样品可满足此要求。

2.3萃取时间、次数的确定

对于本实验选择体积比为2：

1的氯仿-甲醇溶液作为食品中磷脂的萃取溶剂，萃取时间选择至关重要，本实验考察了萃取时间对检测结果的影响，实验结果见表4。

表4提取时间对磷脂检测结果的影响

样品

萃取时间

20min

30min

60min

24h

大豆，mg/g

22.2

23.7

23.5

23.8

花生，mg/g

8.95

9.25

9.20

9.23

鸡心，mg/g

21.8

22.9

23.2

22.7

牛奶，mg/g

14.0

14.8

14.7

14.8

从表4中数据可以看出，对于大豆、花生、鸡心、牛奶等食品来说，添加萃取溶剂30mL，当萃取时间在20min时，检测结果比萃取时间在30min稍微低一点，但当萃取时间超过30min后，随着萃取时间的增加，样品的检测结果值无明显增加，所以本实验最终把萃取时间定为30min。

本实验也考察了样品萃取次数的影响，当萃取时间选定为30min时，考察了两次萃取对实验结果的影响，每次使用萃取溶剂都为30mL。

实验结果显示，萃取一次、两次所得萃取物检测结果值一致。

所以本实验选择在样品中添加30mL溶剂，然后在超声波中萃取30min，只进行单次萃取的操作。

3标准曲线及样品溶液的比色

取六支50mL比色管，编成0、1、2、4、6、8六个号码。

按号码顺序分别注入0.1mg/mL磷酸盐标准储备液0mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL，再按顺序分别加水10mL、9mL、8mL、6mL、4mL、2mL。

接着向六支比色管中分别加入0.015%硫酸联氨溶液8mL，2.5%钼酸钠溶液2mL。

加塞，振摇3次~4次，去塞，将比色管放入沸水浴中加热10min，取出，冷却至室温。

用水稀