纸片扩散法药物敏感试验.docx
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纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验
若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：
一、试验材料：
（一）培养基：
Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方（1L）：
BeefExtract2.0gAcidHydrolysisofCasein17.5g
Starch1.5gAgar17.0g
FinalPH7.3at25℃
高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
（二）药物纸片
抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。
采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。
药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。
用以下两个指标判定纸片的质量：
1、片间差：
是衡量不同纸片含药是否均一的指标。
测定方法：
以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。
35C过夜培养后，记录6个抑菌环直径，其最大和最小之差应小于1～2mm。
2、准确度:
判定纸片的实际含药量与标量是否一致。
纸片的合理保存十分重要。
药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温（-10℃以下）保存。
只拿出少量放4℃备日常工作用。
装纸片的容器从冰箱取出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可打开。
如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，容易潮解。
（三）质控菌株
K—B法质量控制用菌株常规用：
金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。
测定MH琼脂是否适合做磺胺类试验，须用粪链球菌ATCC29212或33186。
上述质控菌株应由卫生部临床检验中心供应。
实验室保存菌株可用冻干法或保存在高层琼脂中。
常规质量控制菌株应每月更换1次。
质控菌株简便保存方法：
将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。
然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。
每月取1支，传种细菌供常规使用。
待用剩至最后1支，再传代在M-H平板上，接种一批高层琼脂管备用。
如此连续可避免原始菌种不接触抗生素，以防变异。
（四）菌液比浊管
为保证敏感试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制。
采用比浊的办法控制菌悬液浓度。
接种菌液浓度为1.5×l08／m1，浊度相当于麦氏标准比浊管第1号管的1／2。
比浊管配法如下：
0.048mol／LBaCl20.5ml
0.18mol／LH2SO499.5ml
将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
使用前剧烈摇动，若出现大颗粒，应更换，有效期为6个月。
二、操作方法
1．制备接种菌液：
临床标本中分离的细菌做药敏试验，应挑取已分离提纯的菌落4～5个制备菌悬液。
制备菌液的方法是挑选琼脂平板上、形态相同的菌落移种于M—H液体培养基中，置35℃水箱中孵育4小时，校正浊度，或用接种环挑取菌落，悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。
此法制备接种菌液适用于任何细菌。
2．接种平板：
制备好的接种菌液必须在15min内使用。
用灭菌的棉拭子蘸取菌液；在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。
用棉拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿平板周边绕两圈，保证涂布均匀。
3．贴纸片：
须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片（开盖晾3—5min）。
用镊子取一张纸片，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，纸片一贴就不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。
每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。
直径为90mm的平板最好不超过6张，直径150mm的平板最好不超过15张。
贴上纸片后，须在15min内倒过来放35℃孵箱培养。
不可放在CO2环境中。
4．孵育：
必须用35℃孵箱，平板在孵箱内最好单独摆放，不超过二个叠在一起，否则中间的平板，达不到孵箱温度而产生预扩散的作用，平板孵育18～24h后，读取结果。
5.判定结果：
培养后取出平板，测量抑菌环的直径。
抑菌环应为正圆形，且包括纸片直径（测量垂直方向取平均值）。
抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
影响因素:
临床中药物敏感性试验主要受到抗菌药物、培养基、细菌、试纸片以及培养条件等因素的影响。
1、药物因素
纸片法药敏试验的结果主要受到药物理化性质以及其作用特点等因素的直接影响。
1.1药物理化性质药物理化性质影响药敏结果的因素有：
药物溶解性、稳定性等。
1.1.1药物溶解性：
药物的溶解性从易溶到极微溶于水不等，易溶于水的药物制成药敏试纸片后在培养基上很容易均匀扩散，而极微溶于水的药物制成药敏片后在培养基上很难完全溶解于培养基中并扩散。
当药物试纸片放置到培养基上之后，不同溶解性的药物在规定的培养时间内扩散到培养基中的程度是不相同的，有的能完全扩散到培养基中，而有的却不能完全扩散，这必然导致该药物的抑菌效果低于真实值。
所以，药物溶解性的高低可以影响药物敏感性试验的结果的真实性，极微溶于水的药物的抑菌环可能低于其真实抑菌效果。
常用溶解度较高的药物有：
氨基糖苷类药物的盐类（硫酸阿米卡星、庆大、链霉素等）、头孢霉素盐类（头孢曲松钠、头孢氨苄、头孢噻肟钠等）、青霉素盐类、喹诺酮类等；而常用的低溶解度的药物有：
氟苯尼考、红霉素、杆菌肽锌、北里霉素、呋喃托因、两性霉素等。
1.1.2药物稳定性的影响：
临床中常用的药物试纸片一般是事先加工好的，极少是现用现做的，所以药品试纸片中药物含量必然受到其稳定性的影响。
有些药物如：
青霉素类、红霉素以及部分头孢菌素在自然条件下是非常不稳定的，它们的效价易受到光照、溶剂、PH值以及温度等诸多因素的影响而降低。
如青霉素钠或钾无论在酸性还是在碱性溶液中都会迅速分解，所以在加工药敏试纸片过程中以及将试纸片放置到培养基上时，溶剂和培养基的PH值都会造成药物效价的降低和药敏结果的降低。
红霉素也是一种很不稳定的药物，它在弱碱情况下较为稳定，但是当PH小于6时红霉素会很快分解，导致药敏试验结果的降低。
另外，许多药物还会受到光照、温度以及储存时间等多种因素的影响而导致抗菌效价降低。
1.2药物作用特点
药物敏感试验结果还受到药物本身作用特点的影响，如药物抗菌作用机理、药物作用适宜PH值、药物有效部位以及各种离子的影响等。
这些因素在一定程度上可以导致抑菌环的变大或变小，在临床中也是不可忽视的因素。
1.2.1药物抗菌作用机理：
临床中的抗菌药物可以简单的分成抑菌药物和杀菌药物两种。
杀菌药物是指药物可以直接作用于细菌静止期和繁殖期将细菌杀灭；而抑菌药物是通过竞争抑制或其他机理只杀灭处于繁殖期的细菌，而对静止期的细菌没有杀灭作用。
由于抑菌药物和杀菌药物对细菌的作用机理不相同，所以纸片法药敏试验时产生的抑菌环（带）的边沿是不相同的。
杀菌药物产生的抑菌环边沿一般是非常明晰清楚，而抑菌药物产生的抑菌环边沿是模糊的，这主要是因为药物扩散后在边沿处的浓度只能杀死部分细菌（或者使细菌形成L型），在边沿处细菌的不同形态形成了模糊的过渡带。
所以在药敏试验结果判断上，抑菌药物和杀菌药物抑菌环（带）大小很难确定，并且随着培养时间的延长和药物的失效，抑菌药物抑菌环（带）边沿未被杀死的细菌有可能又恢复生长，从而导致抑菌环（带）的进一步缩小。
药物的抑菌与杀菌作用可以导致药敏试验结果判断的不准确性。
临床中常用的抑菌药物有：
青霉素类、头孢类、磺胺类、红霉素类、杆菌肽（锌）、林可霉素、四环素类（土霉素、金霉素等）、氯霉素（氟苯尼考）等；杀菌性药物有：
氨基糖苷类（阿米卡星、庆大霉素等）、喹诺酮类（氧氟沙星、恩诺沙星等）等。
1.2.2作用适宜PH值：
临床中许多药物的疗效很大程度上受到溶剂PH的影响。
药物的作用可能因为溶剂PH值的改变而加强或减弱，即药物的作用强弱存在最适宜的PH值。
当然这类药物的试纸片也很容易受到培养基PH值的影响。
如：
氨基糖苷类<3>在弱碱情况下抗菌作用稍有增强；而呋喃托因和呋喃坦啶在酸性条件下比碱性条件下杀菌作用强（PH5时比PH8时分别强100倍、800倍）。
1.2.3药物有效部位：
有些药物的抗菌作用是不能通过体外药敏试验来判断的，如：
乌洛托品、部分中药提取物（穿心莲内酯）等，这些药物在体外一般没有抗菌作用或抗菌作用相当低，它们只有在体内进一步分解（或转化）后才能表现出抗菌作用，所以检测这类药物的抗菌作用是不能通过抑菌环大小来判断的。
这类药物还有：
鞣酸黄连素、金荞麦等。
1.2.4离子的影响：
常用的许多药物可以受到各种离子的影响而导致抗菌作用降低甚至丧失。
如：
喹诺酮类药物、氨基糖苷类、土霉素、金霉素、妥布霉素、泰乐菌素等药物在Ca2+、Mg2+、Al3+等阳离子的作用下（一般是形成不溶性络合物）抗菌作用降低或丧失；许多重金属离子（铜、锌、汞）等可以破坏青霉素钠（或钾）的活性，使其抗菌作用降低。
在药敏试验培养基中如果含有大量这些阳离子就可以直接导致以上药物的抑菌环（带）减小甚至消失，所以在进行药物敏感性试验时应该选用无离子水和高质量的营养琼脂。
1.2.5其他因素：
药物自身性质影响因素还包括药物蛋白结合率、作用温度等多方面因素。
如果一种药物的蛋白质结合率很高或与蛋白质结合力很强，当培养基中存在大量蛋白质时，药物和培养基中蛋白质的结合必然降低药物的抑菌环（带）的大小。
同样，培养温度也在一定程度上影响着药物敏感性试验的结果判断。
2、培养基
药敏试验的结果在很大程度上也受到培养基厚度、用水的质量、PH值以及培养基成分的影响。
2.1培养基厚度：
纸片法药物敏感性试验主要是利用药物扩散原理，药物在培养基上通过扩散在一定范围内形成抑菌药物浓度从而达到抑菌的效果。
抑菌试验常用的培养基厚度一般为5mm左右，而在临床中受到操作者技术的影响，不同平皿培养基的厚度不可能相同甚至差别很大，同种药物不同平皿上的试验结果也不会相同，即培养基厚度越大药物的抑菌环越小。
2.2用水的质量：
制作药物敏感性试验的培养基用水在很大程度上也影响着药敏试验的结果。
用水的影响主要是矿物质离子的影响，如Ca2+、Mg2+、Al3+等离子，它们对药物的影响机理参见与本文的1.3.4节。
2.3PH值：
培养基PH值也是影响药敏试验结果的重要因素之一。
PH值主要是影响药物稳定性和活性。
PH值对药物稳定性和活性的影响参见与本文1.3.2节。
2.4培养基成分：
培养基的配制、营养成分以及杂质的种类等都可以影响药敏试验的结果。
培养基配制浓度较高或融化不良以及厚薄不均等均可能影响药物扩散；培养基中的蛋白质可能和部分蛋白质结合率高的药物结合而影响药敏试验结果。
部分药物蛋白质结合率如下：
青霉素≧50%、盐酸多西环素≧75%（犬）、红霉素≧70%；而氨基糖苷类药物结合率却很低（20%左右）。
培养基中的杂质的种类也可能在某些方面影响药敏试验的结果。
3、细菌因素
细菌的菌层厚薄（或涂菌的多少）和细菌生长的特性是影响药敏结果的主要因素。
药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌环就越小，反之抑菌环就越大。
有些细菌在培养基上生长时会发生移动（鞭毛运动），当药物失效或培养时间太长，这类细菌有可能向已经形成的抑菌环移动，这也导致抑菌结果判断的失误。
4、试纸片因素
药敏试纸片中药物含量多少和试纸片材质是影响药敏试验的主要因素。
4.1药物含量的多少：
试纸片上药物含量的多少应该是影响药敏结果的最主要因素。
由于纸片法药敏试验本身就是一种定性药物敏感性试验，试纸片含药量没有统一规定，各个生产单位都是根据各自的标准进行加工，所以试纸片药物种类和含量不同判断标准也不同，药物之间没有明确的可比性。
目前许多兽药企业自己生产药敏试纸片和产品的药敏试纸片，有的企业为了提高产品的药敏结果而加大产品药敏纸片中药物含量也在所难免，所以通过药敏试验中抑菌环大小来判断细菌对不同药物的敏感性是不严谨的。
4.2试纸片材质：
试纸材质对药敏试纸片中药物稳定性以及活性有很大影响。
加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的定性或定量滤纸，这种滤纸含有杂质少，对药物保存没有太大影响。
但是，临床中许多企业加工的是纸片是选用普通纸，这些普通纸用水浸润后一般为碱性或含有大量无机离子，使用普通纸加工的试纸片药物受到很大影响。
也有些企业使用薄型的滤纸片，加工过程中药物不可能被滤纸片均匀吸收，试纸片药物含量不均必然导致药敏试验结果的不确定。
5、培养条件
药敏试验中培养时间的长短、温度的高低等都是影响药敏试验结果的因素。
本文1.2.1所述的药物作用机理中，抑菌药物的抑菌环边沿是一个模糊范围，当培养时间过长或药物失效，药物的抑菌环大小也就会发生改变；细菌的移动性在培养时间过长时也会影响试验结果的判断（参见第3节细菌因素）；培养温度的高低可以影响细菌的生长状况，这也间接影响药敏试验的结果。
总之，临床中纸片法药敏试验结果受到多种因素的影响，在没有标准和严格操作规程的情况下，抑菌环的大小不能明确体现出一个细菌对药物的敏感度的高低，更不能通过纸片法药敏试验结果判断细菌对不同药物的敏感性的高低。
一种药物抑菌环的有无或大小只能判断出该药对细菌有没有效果，敏感性的高低只能通过科学、严格的实验来确定。
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