第一章蛋白质.docx
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第一章蛋白质
附件五
天津师范大学教案
课程
名称
生物化学
任课
教师
王景安
编号
01
课题
（章节）
第一章蛋白质化学
内容
分析
重点
蛋白质的结构与性质
难点
蛋白质与氨基酸的性质
教学
目的
1、掌握蛋白质基本组成单位—氨基酸的分子结构、结构特点、分类、理化性质。
2、了解蛋白质的分类3、掌握蛋白质分子的基本结构（一级结构）和空间结构（二级结构、三级结构、四级结构）的概念，各种结构的组成方式、特点；掌握超二级结构与结构域的结构特点。
4、掌握蛋白质结构与功能的关系。
5、掌握蛋白质的两性电离、胶体、变性、沉淀、凝固、紫外吸收的性质，掌握蛋白质的茚三酮和双缩脲反应原理。
6、熟悉有机试剂沉淀、盐析、电泳、透析、层析、超速离心等蛋白质分离和纯化的原理。
7、了解多肽链中氨基酸序列分析方法、原理。
教学
方法
讲授与讨论相结合
教学
手段
多媒体教学
教
学
过
程
设
计
第一章蛋白质化学
第一节蛋白质的生物学意义
一、什么是蛋白质
二、蛋白质的生物学作用
第二节蛋白质的元素组成
第三节蛋白质的氨基酸组成
一、氨基酸的结构通式
二、氨基酸的分类及重要性质
第四节体内重要的活性肽
第五节蛋白质的结构
一、蛋白质的一级结构
二、蛋白质的空间结构
三、蛋白质分子中共价键与次级键
第六节蛋白质分子结构与功能的关系
一、蛋白质一级结构与功能的关系
二、蛋白质构像与功能的关系
第七节蛋白质的性质
一、蛋白质的相对分子量﹑两性电离及等电点
二、蛋白质的胶体性质和沉淀反应
三、蛋白质的变性和颜色反应
第八节蛋白质的分类
一、简单蛋白质
二、结合蛋白质
作业与
思考题
《生物化学简明教程》第一章后面第39页的思考题。
课下阅读材料
1．生物化学王镜岩主编2001年10月第三版高等教育出版社出版。
2．现代生物学精要速览（中文版）：
生物化学，2001，王镜岩ISBN7-03-007916-7，科学出版社。
3．生物化学习题集张来群谢丽涛主编，1998年10月第一版，2001年3月第四次印刷，科学出版社出版。
4．现代生物化学于自然主编2001年10月第一版，化学工业出版社
5．生物化学王希成主编2001年10月第一版清华大学出版社
6.21世纪教材基础生物化学郭蔼光主编2001年第一版高等教育出版社。
7．生物化学简明教程聂剑初等合编1999年6月第三版高等教育出版社。
注：
附教学讲义
第一章蛋白质
第一节蛋白质的生物学意义
一、什么是蛋白质？
L—α—AA借肽键相连形成的高分子化合物
O
［肽键：
—C—NH—也叫酰胺键］
二、蛋白质的生物学作用
物质吸收、运输、运动，各种生化反应—E。
信息传递（遗传复制酶）、记忆、疾病防御——抗体；固体酶的工业应用、脱（纺织品）浆、生化制药，都是利用蛋白质的催化作用，蛋白质生物芯片（贮存信息量大，将多种蛋白质抗体固定、排列到玻璃板上，能检测各种疾病蛋白及其他基因表达蛋白），蛋白酶用于皮革的脱毛及软化等等。
第二节蛋白质的组成
一、蛋白质的元素组成：
C（50-55％）、H（6-8）、O（20-30%）、N（15-18）、S（半胱aa）（0-4%）
有的还含有P、Fe、Zn、Mo（钼Fe蛋白）、Cu、I，特别是含N量都很接近16%。
所以，测出含N量×6.25（100/16）即可推测出蛋白质的含量（大致含量）
--凯氏定氮。
二、蛋白质的aa组成
通常只有20种，也称为编码氨基酸。
除Pro外均为α—aa，除甘氨酸外，都有D、L两种异构体（α—碳原子为不对称碳原子），D、L型与旋光方向没有直接的对应关系：
L型既有左旋的又有右旋的（自然存在的），D、L是人为规定的，左旋的用（—）表示，右旋的用（+）表示。
不同氨基酸其旋光方向和比旋光值各不相同表1-2
比旋光值（度）：
1g/ml的溶液放在1dm长的盛液管中测出的旋光度。
COOHCOOH
H2N—C—HH—C—NH2
RR
L—αD—α
20种aa有各种不同的分类方法：
（一）氨基酸的种类
分类一根据侧链基团R的化学结构分为四类：
第一类脂肪族aa：
①一氨基一羧基（中性）：
一氨基一羧基aa中共九种：
H—CH—COOHCH2—CH—COO－CH2—CH—COO－
NH2OHNH+3SHNH+3
（Gly:
glycine）（Ser:
serine）（Cys:
cysteine）
CH3—CH—COO－CH3—CH—CH—COO－CH3—CH—CH—COO－
NH+3OHNH+3CH3NH+3
（Ala:
alanine）（Thr:
threonine）（Val:
valine支链aa）
CH3—S—CH2—CH2—CH—COO－CH3—CH—CH2—CH—COO－
（Leu:
leucine支链aa）
（Met:
methionine）
NH+3CH3NH+3
CH3—CH2—CH—CH—COO－
CH3NH+3
（Ile:
isoleucine支链aa）
②一氨基二羧基aa（酸性）及其酰胺
—OOC—CH2—CH—COO——OOC—CH2—CH2—CH—COO—
NH+3NH+3
（Asp:
asppartate）（Glu:
glutamate）
OO
H2N—C—CH2—CH—COO—H2N—C—CH2—CH2—CH—COO—
NH+3NH+3
（Asn:
asparagine）（Gln:
glutamine）
③二氨基一羧基aa（碱性：
—NH2＞COOH）
H3N+—CH2（CH2）3—CH—COO—H2N—C—NH—（CH2）3—CH—COO—
NH3+NH2+NH3+
（Lys:
lysine）（Arg:
arginine）
第二类芳香族化合物aa（含有苯环的化合物叫做芳香族化合物，有的包括Trp）：
—CH2—CH—COO—HO——CH2—CH—COO—
NH+3
NH+3
（Phe:
phenylalanine）（丙aa取代）（Tyr:
tyrosine）
第三类杂环aa：
HC==C—CH2—CH—COO—………—CH2—CH—COO—…
HN+NHNH+3NNH+3
CH
（His:
histidine咪唑基）（Trp:
tryptophan）
不能放在脂肪族的碱性aa中，因为含N杂环不是碱性脂肪烃类。
第四类脯氨酸，也称杂环亚氨基酸：
由Glu环化、还原与脱羧形成
—COO—
…
NH2+
（Pro:
proline）
分类二按侧链R基团的极性（即在；pH7左右时的解离状态）分为：
非极性：
甘、丙、缬亮、异亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。
不带电荷：
带OH、SH、酰胺基
极性带负电荷（酸性aa）
带正电荷：
Lys、Arg、His（碱性aa）咪唑基等电点为6.0
此外在蛋白质代谢中还有鸟aa、瓜aa、胱aa、羟脯aa、羟赖aa，瓜aa不含胍基：
H2N—C—NH2精aa才含有。
瓜aa含脲基H2N—C—NH—
NHO
人和动物的必需aa：
不能自身合成必须由食物获得。
Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp、His*、Arg*（*半必需aa，儿童合成不足）
蛋白质中的修饰氨基酸：
羟脯氨酸、羟赖氨酸、磷酸丝氨酸等
（二）aa的性质
1.物理性质：
无色结晶，易容于水，不容于有机溶剂，熔点高（Gly：
232℃,乙酸：
16.6℃，分子间靠氢键缔合，液体）。
说明是离子化合物。
2.化学性质：
1）.（难点*）两性解离及等电点：
COO—加碱解离出H+带负电，加H+结合H+带正电，向阴极移动，
在某一pH下带正、负电荷量相等。
H3N+—C—H（由很酸向碱变化NH+3—CH—COOHNH+3—CH—COO—）
RRR
在电场中不移动，此时的pH称为aa的等电点（pI）。
（isoelectricPoint/点）此时aa的溶解度最小（因为静电作用），pI与—COOH和—NH2的解离常数有关。
K1：
—COOH解离为—COO—+H+的解离常数；K2：
H3N+解离为—NH2+H+的解离常数。
其pI可从pK计算或测定（用酸碱滴定法测定）。
aa等电点的计算：
只有一个解离基团的物质AH，其解离常数与pH的关系为pH=pK+lg（[A-]/[AH]）.证明：
AHA—+H+K=[A-]*[H+]/[AH][H+]=K*[AH]/[A-]=K/（[A-]/[AH]）
-lg[H+]=-lgk--lg（[A-]/[AH]）即：
pH=pK+lg（[A-]/[AH]）Henderson-方程。
当有一半解离时，即[A-]=[AH]时，pH=pK，即溶液的pH可由其溶质的解离常数计算而得，溶质的解离常数可查得。
pK：
解离常数K的负对数。
aa可看作二元弱酸（酸性条件）有两个可解离的H+其分步离解如下：
K1（+OH－）
在充分酸的条件下R—CH—COOHR—CH—COO—+H+
NH+3NH+3
（R+）（R0）
K2
R—CH—COO—R—CH—COO—+H+
NH+3NH2
（R0）（R—）
[R0][H+]
[R0][H+]
[R+]
［R+］=∵K1=
K1R0=R+时K1=［H+］
[R-][H+]
[K2][R0]
K2=R—=
[R0][H+]用NaOH滴定到R0=R—时K2=[H+]
等电点时：
aa处于两性离子状态，少数可能解离成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目和趋势相等。
即：
[R—]=[R+]即[R0][H+]/K1=K2[R0]/[H+][H+]2=K2*K1
[H+]2=K1•K2—lg[H+]=pH；—lgK1=pK1；—lgK2=pK2
两边取负对数得2×—lg[H+]＝—lgK1＋—lgK2即：
pH=[pK1+pK2]/2=pI
分子的存在状态是多种多样的，但在一定条件下以某一方式为主。
即aa的等电点pI就是两性离子两侧的pK值的平均值。
基团的pK值可查得，故pI值可由二pK值计算得之。
对于有三个解离基团的aa，如Asp、Lys只要取其兼性离子两侧的pK值的平均值即得pI值。
COOHCOO—COO—
CH—NH+3K1CH—NH+3K2CH—NH+3K3Asp=
CH2CH2CH2
COOHCOOHCOO—
Asp+（R+）Asp0（R0）Asp—（R—）
等电点时Asp主要以兼性离子R0存在，（R+）与（R—）很小且相等（等电状态为理想状态，pI为理论值）。
pI=（pK1+pK2）/2同上
赖aa:
COOHCOO—COO—COO—
CH—NH+3K1CH—NH+3K2CH—NH2K3CH—NH2
（CH2）4（CH2）4（CH2）4（CH2）4
NH+3NH+3NH+3NH2
（R2+）（R+）（R0）（R—）
pI=（Pk2+pK3）/2因R2+可忽略不计（pI时可认为它是不存在的，否则就不是等电状态了）。
ε—NH2比α—NH2碱性强，结合H+能力大，结合后不易放出。
3.氨基酸的化学性质：
⑴与强酸、强碱都可生成盐（铵盐与羧酸盐）略
⑵与水合茚三酮的反应，pH5-7,80-100℃的条件下，首先使aa氧化脱羧脱氨形成醛，而本身被还原成还原成还原型茚三酮，然后还原型茚三酮、氨和另一分子的水合茚三酮缩合形成蓝紫色的二酮茚—二酮茚胺，这是α—aa定性定量测定的基础，反应如下
+NH3+
（二酮茚-二酮茚胺紫兰色吸收峰570nm）Pro、羟—Pro生成黄色物质（因为无氨基）
用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。
因为产生CO2，也可用CO2气体分析法测定aa（只限于α-氨基酸），肽和蛋白也有此反应，肽越大灵敏度越差，因为游离的α—NH+3和α—COOH比例小。
⑶与亚硝酸的反应（也是aa的NH2基被氧化成—OH），+NH3—N被氧化成N2，HNO2—N被还原为N2，等量进行。
所以N2一半来自HNO2（其他伯氨基均可）。
生成N2的反应叫vanslyke（范斯莱克）反应。
可测N2量（体积）计算氨基的含量。
用于测定蛋白质的水解程度。
⑷与甲醛的反应：
酸碱滴定没有适宜的指示剂（因为等当点过高或过低）。
其氨基可与甲醛反应（加成），生成N—羟甲基或N，N—二羟甲基aa。
使NH+3变为NH2释放出H+。
使溶液酸性增强，可用NaOH滴定之。
与NH2的含量相当，即aa含量。
这就是aa的甲醛滴定法，（滴定到放出的H+被中和时的pH为终点）。
R－CH－COO－R－CH－COO－+H+
+NH3NH2
+HCHO
R－CH－COO－
NHCH2OH
+HCHO
R－CH－COO－
N（CH2OH）2
⑸与2，4—二硝基氟苯的反应（胺与卤代烷的反应）NH3的烷基化，生成黄色DNP—aa，不被酸水解。
也可用之测肽和蛋白质的N—端aa，反应后酸解得N端的DNP—aa，有机溶剂提取分离，层析与标准氨基酸对比即可鉴定之。
Cl
DNFB丹磺酰氯
Sanger试剂（5—二甲氨基萘磺酰氯）
NO2
NO2
RHR
+H2N—CH—COOH—CH—COOH
因为丹磺酰aa有强烈的荧光，所以可用荧光光度计测定。
（均在试剂与—NH2之间脱去卤化氢）均称Sangar反应。
DNFB亦可与非α－氨基反应,如可生成：
δ－DNP-鸟氨酸。
+aa
SR
NH－C－NH－CH－COOH
R
N=C=S
⑹与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应，称艾德曼反应（Edman）反应：
弱碱性条件下，形成苯氨基硫甲酰aa（PTCaa），在无水酸（硝基甲苯中与酸作用）环化为苯乙内酰硫脲氨基酸，或叫苯硫乙内酰脲衍生物（简称PTH或PTH-氨基酸）。
PTH在无水酸中极稳定。
PTC基的引入使紧接着的肽键减弱，所以在无水酸中只切下之（环化断裂同时发生）
PTH—aa在紫外区有强吸收。
Vmax=268nm.PTH—aa可用各种层析技术分离，紫外分析测定与标准PTH—aa对比即可知为何种aa（N—末端），多肽、蛋白的N—末端aa也可与PITC反应，不断重复可得蛋白质aa顺序，多肽的aa顺序自动分析仪（方法产业化）即以此原理设计而成。
7.成肽反应：
肽即氨基酸脱水缩合而成的化合物
R—CH—COOH+H2N—CH—COOHR—CH—CO—NH—CH—COOH
NH2RNH2R
二肽、三肽……含一个自由的α—氨基与羧基，还可缩合为多肽蛋白质=多肽链（链状结构）
活性肽：
谷胱甘肽GSH*Glu的r羧基——Cys的α—氨基缩合成r肽键：
SH
COOHOCH2OH
CH—（CH2）2—C—NH—CH—C—NH—C—COOH
NH22HH
GSSG（氧化还原酶的辅酶—SH）
催产素与加压素（激素类）短杆菌肽、放线菌素D等。
前者使子宫与乳腺平滑肌收缩二者只有两个aa不同：
8Leu8Arg3Ile3Phe所以有催产和促排乳作用，后者则使血管平滑肌收缩的使血压升高（也使肾小球血管收缩形成尿减少）（也是血压升高的原因之一）。
所以也叫抗利尿激素，也与学习的记忆过程有关。
H3N+
S
O
Cys
S
9肽
Cys
Gly—C—NH2
加压素
C端Met
脑啡肽：
许多有镇痛作用：
C端Leu（Leu脑啡肽已人工合成）
似吗啡有镇痛作用但不上瘾
（5肽）Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
促肾上腺皮质激素（ACTH39肽，脑垂体分泌）、
胆囊收缩素（33肽，十二指肠分泌）括约肌收缩，胆汁分泌减少引起厌食
胰高血糖素（29肽，胰岛α-细胞分泌）
8与荧光胺反应（α—氨基）：
产物具有荧光
R
N—CH—COOH+CO2
+aa
O
HO
荧光胺荧光产物
（被390nm光激发，发射475nm的荧光）ng级
9.与5，5/—双硫基—双（2—硝基苯甲酸）反应。
测半胱aa（Cys）等的游离—SH含量，生成含—SH的硝基苯甲酸产物OD412nm有一吸收峰可测之Cys的含量。
COOH
COOH
CH2—CH—COO－
SHNH+3+
H
Cys
5，5/—双硫基—双（2—硝基苯甲酸）硫代硝基苯甲酸
（吸收峰412nm）
（三）aa制备与分析（可略）
制备：
蛋白水解：
毛发水解（H+）胱aa、半胱氨酸
发酵：
Glu菌发酵Glu钠
化学合成：
α—酮酸+NH3aa
分离：
层析与电泳
第三节蛋白质的结构
蛋白质多肽链可分为四级结构。
一、蛋白质的一级结构：
其aa种类、连接方式及排列顺序，不应包括二硫键。
H2N—CH—CO—NH—CH—CO—NH—CH—CO……—NH—CH—COOH
R1R2R3Rn
—NH—CH—CO—
（称为aa残基）
R
一级结构不等于共价结构，只涉及α—C原子的构型
成环则无
书写：
N端（氨基末端）：
有自由氨基的一端写在左边用H表示
C端（羧基末端）：
有自由羧基的一端写在右边用OH表示
连接方式：
—CO—NH—。
—S—S—与稳定肽链的空间结构和生物活性有关
如胰岛素：
51aa（分子质量5734）21A+30B
OH
研究方法：
测定蛋白质的aa顺序。
Edman法一次只能测定60-70个aa残基的肽段
1.测定aa组成。
酸解、碱解，可避免多肽链的aa丢失。
2.测N、C末端aa。
DNFB法等，确定肽链的数目，（羧肽酶A释放除Pro、Arg和Lys的所有C末端残基，羧肽酶B只水解Arg和Lys为C末端残基的肽键）
3.用两种以上的方法将蛋白质断裂为不同的肽段。
如用不同的酶水解。
4.分离各肽段，并测出它们的序列。
Edman法
5.根据各肽段的重叠部分推出蛋白质中的全部aa排序。
也可DNA测序后反推。
关键是小肽段aa顺序的测定：
Edman反应（降解法）与外肽EE解法。
如：
化整为零：
一十肽，A水解法得4个小肽：
A1:
Ala－Phe；A2:
Gly－Lys－Asn－Tyr；A3:
Arg－Tyr；A4:
His－Val
B水解法得3个小肽：
B1:
Ala－Phe－Gly－Lys；
B2:
Asn－Tyr－Arg
B3:
Tyr－His－Val.
根据重叠结构拼接为：
Ala－Phe－Gly－Lys－Asn－Tyr－Arg－Tyr－His－Val
如果含两条以上的肽链先变性分成单链，若含二硫键需先拆开：
过甲酸氧化形成二个半胱氨磺酸（或用β-巯基乙醇还原后用碘乙酸保护-形成羧甲基衍生物）：
HCOOOH
-CH2-S-S-CH2--CH2-SO3H+-CH2-SO3H
O
O
—S—S—可用过甲酸氧化（HC—O—O—H）使之氧化为两个半胱氨磺酸。
—SO3H（—S—OH：
硫酸的一个羟基被烃基取代而成）分析时即知—S—S—的位
O
置（可先水解成只含一个或少量—S—S—的小肽段，以便确定—S—S—的准确连接位置）。
+
二硫键位置的确定
+-
-
一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。
常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。
肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pH6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。
将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。
用茚三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，即可确定二硫键位置。
提取
DNA测序后反推蛋白：
蛋白质抗体蛋白mRNA反转录cRNA测序反推。
第2课时
二、蛋白质的空间结构
多肽链按一定方式盘绕折叠，形成立体（空间）结构（各基团的作用力之故）。
也称蛋白质的构象（或高级结构）：
指蛋白质分子中所有原子在空间的排列及肽链的走向，以一级结构为基础。
肽键及肽键平面，双键性质（不能自由旋转）
OOCαH
Cα—C—N—Cα—C—N—CαC=N0O与H成反式
HHO—Cα
亚氨基
肽键中的4个原子—CO—NH—（—羧基与另一aa的氨基构成）和与之相连的两个Cα原子都处于同一平面上。
这个平面叫肽键平面，Ｃ＝Ｏ 有部分单键的性质，只有Ｎ—Cα ，Ｃ—Cα键可以旋转。
多肽的主链由许多肽键平面构成，平面可以Cα为顶点绕N—Cα和C—Cα键旋转，但受侧链基团的影响，只有少数的特定结构。
所以肽链折叠有一定的限制，分为二、过渡、三、四级结构。
1.Pr的二级结构：
指多肽链本身的折叠与盘绕方式，驱使蛋白质折叠的主要动力来自各侧链基团及其与介质的相互作用（H键维持系统的能量平衡）。
主要有α—螺旋结构、β—折叠、β—转角、无规则卷曲四种。
1）α—螺旋结构：
毛、发、羽毛中的α—角蛋白中的主要形式，多肽链盘绕成右手或左手螺旋（是由肽键平面绕Cα相继旋转一定的角度形成的）。
典型的右手
N
①3.6aa残基为一圈，高0.54nm0.54/3.6=0.15nm，3600/3.6=1000
②侧链R基伸向螺旋外侧;相邻螺旋圈的C=O氧与亚氨基（NH）氢间形成链内H键，每个残基C=O都与它后面的第四个aa残基（隔三隔aa残基）形成H键，氢键平行中心轴。
OHOH
—C—NH—C—C—N—nS3.613（3×3）+4=13
3
R
s：
形成氢键封闭（合）环内的原子数，几乎全为右手螺旋（也有极少数左手螺旋）。
但整条肽链并非全是，如有Pro存在时，即中断（无H可形成H键）。
带同电荷的aa出现在邻近位置上也影响螺旋的形成。
2）β—折叠结构：
O=CCNC
纵向排列形成片层N-H
NNNNCN
平行（角蛋白）反平行（丝心蛋
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